邱玲：国产高效液相色谱仪测定血清25羟维生素D₂和25羟维生素D₃性能评价

本文刊载于《临床实验室》杂志2023年5月刊“质谱检测技术临床应用”专题-「仪器与试剂评价」版块

作者：唐月明  吴政辉  邱玲  禹松林

单位：北京，中国医学科学院北京协和医院检验科（唐月明 邱玲 禹松林）；江苏昆山，江苏豪思睦可生物科技有限公司（吴政辉）

摘要

目的 

基于国产高效液相色谱仪（HPLC）建立25羟维生素D2 [25（OH）D2]和25羟维生素D3 [25（OH）D3]的测定方法，并进行方法学评价。

方法 

采用硫酸锌水溶液沉淀蛋白，以月桂基苯甲酮为内标，加入乙酸乙酯进行萃取，氮气吹干，复溶，进行HPLC检测。以水和乙腈为流动相进行梯度洗脱，25（OH）D2和25（OH）D3的检测波长为264 nm，内标的检测波长为275 nm。评价方法的线性、加标回收率、精密度、基质效应和抗干扰能力等。用本方法和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）同时测定167例临床样本，考察方法的一致性。

结果 

两种待测分析物的保留时间分别为9.2 min和12.7 min，两峰分离良好。检测线性范围为7~100 ng/ml，线性相关系数> 0.995; 25（OH）D2的加样回收率为106%（93%-120%），25（OH）D3的加样回收率为110%（103%~118%）；25（OH）D2总不精密度（CV）的平均值为6.6%（6.3%-7.0%），批内CV为6.1%（5.2%-7.2%）, 25（OH）D3总CV的平均值7.0% （3.6%-10.2%），批内CV为6.9% （4.1%-9.6%）；维生素D2/D3、去氢胆酸、甘油三酯、牛血红蛋白、胆固醇和胆红素等干扰物，在目标峰保留时间没有出峰。随机测定167例样本，比对结果显示，HPLC测定25（OH）D2、25（OH）D3与总25（OH）D 的结果与LC-MS/MS测定结果相关系数均> 0.95，平均偏差分别为-0.1（-3.6~3.3）、0.6（-7.2~8.3）和0.3（-8.8~9.5）ng/mL。

结论：

本研究建立了国产HPLC同时检测血清25（OH）D2和25（OH）D3的方法，该方法回收率好、精密度高，且价格低廉，为基层医院同时进行血清25（OH）D2和25（OH）D3检测的推广提供了方法学基础。 

维生素D不仅作为人体肌肉和骨骼系统的重要维生素，也已被发现与众多慢性病、肿瘤、自身免疫病，甚至和新型冠状病毒的流行相关。世界范围内维生素D缺乏仍旧普遍存在，因此能够准确、及时、简便的测量维生素D具有十分重要的公共卫生意义。25羟维生素D [25（OH）D]，是维生素D在体内的主要循环形式，包括25羟维生素D2 [25（OH）D2] 和25羟维生素D3 [25（OH）D3]。有研究报道，25（OH）D2和25（OH）D3的半衰期不同，活性也可能存在差异，因此为了给维生素D代谢研究和补充剂量检测提供更可靠的方法，需要分别准确定量25（OH）D2和25（OH）D3 。现有的25（OH）D的测量方法主要为免疫学方法、高效液相色谱（HPLC）法和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）。免疫法虽然可以批量操作，但只能测得总25（OH）D，且可能出现交叉干扰的现象。LC-MS/MS是目前公认的金标准方法，但是质谱仪器价格昂贵，仪器操作对人员要求高，不易在基层医院进行推广。而HPLC法价格相对较低，随着国产色谱仪的发展，国内医院将较容易获得。因此，本研究建立并评价了国产HPLC测定25（OH）D2和25（OH）D3的方法，以期为维生素D测量的应用及普及提供方法学依据。  

材料与方法

一、材料

1.仪器、试剂和血清样品：ARIES LC2300 LAB液相色谱（睦仪，中国）、岛津C18色谱柱（5μm,  4.6×150mm，岛津，日本）、Sorvall ST16R离心机（Thermo Scientific，美国）、MTN一2800D氮吹仪（Auto science，中国天津）、96孔U型板（岛津，日本）。

校准品和质控品（BePure，中国）、BSA和PBS（鼠来宝，中国）、硫酸锌（国药，中国）作为沉淀剂，乙酸乙酯（Honeywell，美国）作为萃取液、月桂基苯甲酮（TCI，日本）作为内标、水（屈臣氏，中国），乙腈和甲醇（Sigma-Aldrich，美国）作为流动相。

方法学研究所用血清样品为北京协和医院检验科2021年9月至10月之间门诊患者混合血清样本。

二、方法

1.标准原液和内标溶液的配制：用甲醇将25（OH）D2和25（OH）D3标准品精密配制成浓度为70、100、200、500、800、1000 ng/mL的标曲储存液。采用乙酸乙酯溶解月桂基苯甲酮，配制成1 ng/mL的内标溶液。标曲原液和内标溶液分装后-20℃保存备用。

2.样品制备：精密吸取0.03 mL标曲原液和0.27 mL含1%BSA的PBS溶液，加入到2 mL离心管中，配置成7、10、20、50、80和100 ng/ml的标曲溶液。精密吸取0.3 ml血清样本加入到2 mL离心管中。分别向上述离心管中，加0.15 ml 0.2 mol/L的硫酸锌水溶液，轻摇震荡5 s；加入0.8 ml乙酸乙酯，涡旋震荡15 min；4 ℃、10000 rpm离心10 min；吸取0.6 ml上清液置于96孔U型板中；室温下，置于氮吹仪中，60℃氮气吹干；80 μl乙腈：水（80：20）复溶，置于HPLC中进行检测。

3.色谱条件：采用岛津C18色谱柱（4.6×150mm, 5μm），以水为A相，乙腈为B相，采用梯度洗脱，洗脱浓度见表1。柱温45℃，进样量50 μl，流速1 ml/min，25（OH）D2和25（OH）D3的波长为264 nm，内标的波长为275 nm，运行时间为22 min。

表1  HPLC梯度洗脱浓度

4.线性和定量限（limit of quantification, LOQ）:以标准溶液浓度/内标浓度为横坐标（X），标准溶液峰面积/内标峰面积为纵坐标（Y），b为回归系数，a为截距，进行线性回归，得到线性回归方程（Y=bX+a），计算相关系数R。

LOQ：通过检测标准曲线线性最低点来考察方法定量限，连续进样检测20次，计算浓度、相对偏差和不精密度（coefficient of variation, CV），要求相对偏差＜±15%，CV＜20%。

5.加样回收实验:混合血清分别加入低、中、高三种水平标准溶液，每个浓度平行处理2份，取均值计算加样回收率。

6.精密度实验:由于人血清中25（OH）D2含量极少，因此向含有低、中、高浓度25（OH）D3的混合人血清中加入25（OH）D2标准溶液，配成25（OH）D2和25（OH）D3均含有三个不同浓度的混合血清。连续分析5天，每天每个浓度平行处理5份，分别计算平均值、批内精密度和批间精密度。

7.基质效应评价:按照本实验的前处理方法处理混合血清和1%BSA的PBS基质样本。取上清液，并在1%BSA的PBS基质样本上清液（A）和3份血清上清液（B）中加入相同浓度的标准品及内标，在1份上清液中补入同样体积甲醇溶液和内标（C），计算标准品峰面积与内标峰面积比值，按照（B-C）/A*100%的公式计算基质效应。

8.干扰评价:为评价干扰物否对目标峰出峰时间及峰面积是否产生影响，向标准溶液中分别加入维生素D2（750ng/ml）、维生素D3（750ng/ml）、向血清中分别加入去氢胆酸（150μg/ml）、甘油三酯（24mg/ml）、胆红素（0.2mg/ml）、牛血红蛋白（2mg/ml）、胆固醇（5mg/ml），比较干扰物峰、目标峰的出峰时间及峰面积，以判断是否对目标峰干扰。

9.方法学比对：收集2021年9月167例在北京协和医院用自建LC-MS/MS方法进行25（OH）D2和25（OH）D3检测的血清样本，用本HPLC法测定25（OH）D2和25（OH）D3，进行方法学比对。

10.统计学分析：采用Excel软件及Medcal 20.218进行数据整理与统计学分析，用Bland Altman及Passing-bablok回归进行检测结果一致性比较，P <0.05为差异具有统计学意义。  

结果

1.液相色谱分析结果:标准溶液和血清标本经前处理后，HPLC色谱图如图1：25（OH）D2、25（OH）D3和内标保留时间分别为9.2 min、 12.7 min和19.5 min，色谱峰分离良好，整体洗脱时间为22 min。

注：蓝色为标准溶液，红色为血清样本

图1 25（OH）D2和25（OH）D3    

2.线性和LOQ:本方法25（OH）D2和25（OH）D3的测定范围均为 7-100 ng/ml，线性良好，5次实验的相关系数R均> 0.997，详见表2。25（OH）D2和25（OH）D3的LOQ均为7 ng/ml，相对偏差< ±15%，CV分别为7.7% [25（OH）D2]和6.4% [25（OH）D2]。

表2  25（OH）D2和25（OH）D3的线性回归方程及相关系数R

3. 加样回收率:如表3所示，HPLC测试血清样本25（OH）D2的加样回收率为106%（93%-120%），25（OH）D3的加样回收率为110%（103%~118%）。  

表3  25（OH）D2和25（OH）D3的加样回收率

4.精密度:HPLC测定不同浓度血清样本25（OH）D2和25（OH）D3的精密度结果显示如表4。25（OH）D2总CV的平均值为6.6%（6.3%-7.0%），批内CV为6.1%（5.2%-7.2%）,和25（OH）D3总CV的平均值7.0% （3.6%-10.2%）,批内CV为6.9% （4.1%-9.6%）。  

表4  25（OH）D2和25（OH）D3的精密度

5.基质效应评价:如表5，HPLC法测定血清样本25（OH）D2和25（OH）D3相对回收率分别为104%（98%-109%）和88%（87%-89%），内标的添加抵消了基质效应，增加测定结果的准确性。  

表5  HPLC法测25（OH）D2和25（OH）D3的基质效应

6.干扰评价:在标准溶液中加入维生素D2和维生素D3后，25（OH）D2和25（OH）D3保留时间内均无干扰物出峰。在血清样本中，去氢胆酸、甘油三酯、胆红素、牛血红蛋白、胆固醇均未在25（OH）D3保留时间内出峰，且加入不同干扰物后，25（OH）D3的计算浓度偏差＜15%，且CV=10.1%。

7.临床标本测定:应用北京协和医院自建LC-MS/MS法和本研究建立的HPLC法检测血清样本167例，使用Bland-Altman偏差图及Passing-bablok回归图评估两种方法测定25（OH）D2、 25（OH）D3和总25（OH）D的一致性，如图2所示。Bland-Altman图显示两方法之间25（OH）D2的平均偏差（±1.96SD）为-0.1（-3.6-+3.3）ng/ml, 25（OH）D3为0.6（-7.2-+8.3）ng/ml，总25（OH）D 为0.3（-8.8-9.5）ng/ml。25（OH）D2、25（OH）D3和25（OH）D在两种方法中测得的浓度相关系数r分别为0.95、0.97、0.96（P＜0.001），表明两种方法一致性良好。 

注：[A、B、C 分别为25（OH）D2、 25（OH）D3和总25（OH）D的Passing-bablok回归图；D、E、F 分别为25（OH）D2、 25（OH）D3和总25（OH）D的Bland Altman图]  

图2  25（OH）D2、 25（OH）D3和总25（OH）D的Passing-bablok回归图及Bland Altman偏差图  

讨论

维生素D2主要来自于酵母菌和植物性食物等；维生素D3主要是皮肤受紫外照射后产生，部分可以来源于鱼肝油、牛奶等食物等。维生素D2和维生素D3被运送到肝脏，分别生成25（OH）D2和25（OH）D3，之后转运至肾脏，产生具有活性的1，25-（OH）2D。但是由于1，25-（OH）2D血液中含量低（pg/ml）和短半衰期（4-6h），因此25（OH）D2和25（OH）D3成为评估体内维生素D含量的重要代谢物。

目前，测量25（OH）D2和25（OH）D3的方法主要包括免疫法、HPLC和LC-MS/MS法。由于对维生素D的检测需求呈指数型增长，免疫法因为可以有自动化仪器，从而成为筛查方法首选。但是免疫分析法常常因为试剂抗体特异性差而和其他25（OH）D代谢物或异嗜性抗体等存在交叉反应原因，导致免疫分析法检测结果具有较高的变异性。虽然国内有研究报道，免疫法与其他两种方法一致性较高: 电化学发光免疫分析法和LC-MS/MS法的相关性为r=0.9268，酶联免疫吸附法和HPLC法的相关性为r=0.88。但是，国外研究认为免疫法、HPLC和LC-MS/MS法的一致性并不理想。由于抗体的限制性，免疫法多测得是总25（OH）D，而无法区分25（OH）D2和25（OH）D3。Garnett等人发现免疫法对25（OH）D2的回收率差，且在高浓度时25（OH）D2具有更显著的负偏倚，因此用免疫法测定补充25（OH）D2时的结果应该谨慎。此外免疫法因为需要维生素D和结合蛋白解离，并且25（OH）D2和25（OH）D3具有不同的亲和常数，因此需要有效的解离方法来获得准确的回收率。

LC-MS/MS法作为定量的金标准，相比HPLC法，根据母离子和子离子的核质比进行离子识别而具有更高特异性。但是MS的高精密度极易收到电压、离子源污染和四极杆状态的限制，重复性较低，需要专业的仪器维护及严格的条件控制。因此，昂贵的仪器和需要专人的操作限制了LC-MS/MS的使用，目前更推荐在研究型实验室进行科学探索或者高级医院确诊使用。

HPLC法根据不同代谢物的不同吸光度，结合代谢物在色谱柱的不同保留时间，比免疫法能够更特异性的识别被测物，分离能效高。前处理会彻底使结合蛋白质变性并被去除，不会存在解离过程中是损失，从而使得检测结果具有更高的准确性。相比LC-MS/MS，HPLC不需要考虑MS内部精密的仪器维护和操作条件，分析稳定性更高。随着国产HPLC的发展，仪器投入成本大大减少，基层医院推广可能性增强。 

随着近些年LC-MS/MS方法的发展，国内HPLC法多停留在5年前的报道。 有的检测基质非血液，有的基于血液但是需要固相萃取柱净化。此外，25（OH）D2在血清中浓度极低，HPLC等方法普遍较难达到较高的敏感度，国内尚未有报道 HPLC测定25（OH）D2。但是本实验相比过去研究，提高了加入乙酸乙酯，提高了分离性能，可以同时测定25（OH）D2和25（OH）D3；提高了检测敏感度，血清样品用量仅需300μl；不需要固相萃取，操作更加简单；内标的加入也一定程度上抵消了基质效应，回收率提高 。在与LC-MS/MS法测定人群样本比对结果中，可以看到两种方法相关性良好，对比结果一致性高，表明本方法准确性高。

综上所述，本研究建立了国产HPLC同时检测血清25（OH）D2和25（OH）D3的方法，样本用量少，总体回收率好、精密度高、抗干扰能力强和准确性高。此外，国产HPLC价格低，容易推广，便于基层医院大规模进行血清25（OH）D2和25（OH）D3的检测。  

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题图 | veer.com

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审校 | 方研

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