双载荷ADC的发展

目前已经有一些公司在开发双载荷ADC药物，最常见的双载荷ADC合成策略是将两种药物安装在同一个linker上。

2017年，Levengood等人披露了首个双载荷ADC，该ADC在含有正交保护的半胱氨酸残基的短肽连接体上偶联MMAE和MMAF，DAR为16（8+8）。

为了合成ADC，首先用TCEP还原天然抗体的链间二硫化物，然后将游离的硫醇添加到侧链马来酰亚胺中，偶联dual-Cys linker。这使得抗体上安装8个linker，可添加16个载荷。随后依次解除半胱氨酸残基的掩蔽，就可以连接两种不同的药物。

为了安装第一种药物，连接体-抗体构建体用TCEP处理，以去除第一个linker上的S‐(isopropyl) disulfides，然后通过硫醇将暴露的Cys 残基与 mc-MMAF 偶联。

接下来，单药ADC用Hg(OAc)2水溶液处理，以去除Acm保护基，然后用Quadrasil MP树脂纯化，以去除多余的Hg2+。最后偶联mc-vc-MMAE，得到双载荷ADC。

MMAE和MMAF具有互补的理化特性，MMAE具有细胞渗透性和旁观者效应，但对MDR高表达细胞的活性降低；MMAF对MDR+细胞具有活性，但细胞渗透性小。进一步的活性分析表明，生成的双载荷ADC显示出强大的抗肿瘤活性，同时可以通过添加互补载荷来克服肿瘤细胞耐药。

2018年，Kumar等人报道了第二个双载荷ADC，是由MMAE和吡咯并二氮杂卓（PBD）二聚体构成。

payloads结构

在这项研究中，合成了一个分支linker，这个linker包含一个自稳定的N-芳基马来酰亚胺，用于与抗体上的特异性硫醇结合。

linker上的炔基和酮基用于偶联药物，炔基通过铜催化的叠氮-烷基环化反应（CuAAC）来容纳任何叠氮装饰的药物，酮基可以通过肟连接来容纳带氨基的药物。

首先，通过TCEP还原和脱氢抗坏血酸（DHAA）再氧化产生工程化的半胱氨酸293，然后用linker进行硫醇-马来酰亚胺偶联，每个抗体两个linker，并通过陶瓷羟基磷灰石（CHT）色谱法进行纯化。

Schematic representation of the synthesized linker antibody constructs.

第一种载荷MMAE通过肟连接，第二种载荷PBD-SG3557通过CuAAC安装，二者通过CHT色谱法进行纯化。这个方法总共需要对抗体进行三个合成步骤，每个步骤后进行纯化。

Schematic representation of ADCsynthesized using the heterotrifunctional linker1and cytotoxic payloads O-vc-PAB-MMAE and SG3457.

对构建的双载荷ADC进行体外活性测定，发现双载荷ADC与PBD单药ADC具有同等高效的抗肿瘤活性。

Her2-expressing MDA-MB-453breast cancer cell lines.

2021年开发的双载荷ADC，是通过点击化学生成均一ADC，DAR组合可灵活调整为2+2,4+2和2+4。

研究设计了一个含有叠氮化物azide和me-tetrazine的支链连接子，其中azide-二苯并环辛烯（DBCO）为一个点击化学对，me-tetrazine和反式环辛烯（TCO）为一个点击化学对，me-tetrazine-TCO环化反应不会引起azide-DBCO之间的交叉偶联。点击化学对与PEG间隔物、GluValCit可裂解连接子、PABC和载荷（MMAE/MMAF）偶联。

对构建的双载荷ADC进行体外毒性研究发现，双载荷ADC在HER2低表达且对疏水性化疗药物耐药的乳腺癌JIMT-1细胞系中仍具有很好的抗肿瘤活性。

此外，对于具有HER2异质性/耐药性的异种移植乳腺肿瘤模型，双载荷ADC表现出比单药ADC或两种ADC联合用药更好的抗肿瘤活性。

当然，除了同一连接子上偶联不同的载荷，还有另一种偶联方式，即在抗体不同位点偶联不同载荷。2019年报道了一种通过工程化硒半胱氨酸（Sec）和半胱氨酸（Cys）残基偶联MMAF和DNA损伤剂PNU-159682来构建双载荷ADC。

目前一些企业也已经布局双载荷ADC，如启德医药通过位点特异性偶联技术iLDC/ iGDC，将拓扑异构酶I抑制剂与免疫激动剂两种载荷与抗Trop2 mAb偶联，在临床前研究中，该药物表现出肿瘤杀伤能力的增强并免疫记忆的延长。

总结来说，目前双载荷ADC有同一位点和不同位点两种构建方式，从目前的一些研究结果来看，双载荷ADC可以根据治疗目的灵活调整DAR，使其具有不同的疗效，在某些肿瘤类型中（如异质性，耐药）表现出更好的抗肿瘤疗效，但双载荷ADC真正应用于肿瘤治疗仍然任重道远。

参考

[1]doi:10.1002/anie.201608292

[2]https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2018.10.043

[3]https://doi.org/10.1038/s41467-021-23793-7

[4] doi:10.1093/abt/tbz009

[5]DOI:https://doi.org/10.14229/jadc.2023.01.05.001.

[6]doi:10.1158/1078-0432.CCR-04-1845

打赏