高结构亲和力新抗原特异性CD8 T细胞优先驻留并清除肿瘤

癌症免疫治疗的成功在一定程度上取决于T细胞对抗原的识别能力。这里表征了371个CD8 T细胞克隆的TCR功能(抗原敏感性)和结构(单体pMHC-TCR脱落率)的亲和力，这些克隆是从患者和健康捐赠者的肿瘤或血液中分离出来的新抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原的特异性TCR。来自肿瘤的T细胞在功能和结构上表现出比血液T细胞更强的亲和力。相对于TAA，新抗原特异性T细胞具有更高的结构亲和力，并且一致地优先在肿瘤中被检测到。在小鼠模型中，有效的肿瘤浸润与高结构亲和力和CXCR3表达有关。基于TCR的生物物理化学性质，推导并应用了一个预测TCR结构亲和力的计算机模型，并验证了患者肿瘤中高亲和力T细胞的富集性。这些观察结果表明，新抗原识别、T细胞功能和肿瘤浸润之间存在直接关系。这里结果描述了一种合理的方法来识别有效的T细胞，用于个性化的癌症免疫治疗。

既LICR(路德维希癌症研究所) Nature Communications,(2018)在卵巢癌中使用灵敏的方法鉴定高亲和力新表位特异性CD8 T细胞之后，近日又在Nature Communications,(2023)发表高结构亲和力新抗原特异性CD8 T细胞优先驻留并清除肿瘤，为个体化TCR的免疫治疗提供一种特异性T细胞的预测和鉴定方法。

T细胞功能部分取决于TCR对其同源pMHC的亲和力。因为这是由结构决定的，所以它被称为结构亲和力，它是由单体pMHC和TCRs的解离动力学决定的。相反，对抗原的敏感性反映了TCR的特性，但也反映了细胞的功能状态，因此被称为功能性亲和力。在小鼠和人身上的研究表明，CD8 T细胞的结构和功能亲和力与T细胞功能相关并决定T细胞功能。亲和力如何影响肿瘤特异性T细胞的肿瘤植入目前还不是很清楚。然而，这是影响以T细胞为基础的免疫疗法成功的关键参数。

在这里，广泛地评估了新抗原特异性T细胞的结构亲和力和抗原敏感性，并询问这些是否与肿瘤浸润和归巢能力相关。分析了一个大型的CD8 T细胞库，这些细胞来自健康捐赠者和黑色素瘤、卵巢癌、肺癌或结直肠癌患者的肿瘤和外周血中的新抗原、TAA和病毒特异性表位。尽管新抗原特异性T细胞表现出比TAA特异性细胞更高的亲和力，但仍可观察到广泛的亲和力。高克隆型亲和力与肿瘤的稳定驻留、CXCR3的高表达和ACT后小鼠的肿瘤植入性特异性相关。最后，证明了高亲和力的TCR具有生物物理化学性质使能够产生TCR亲和力的计算机预测因子。提示抗原识别强度、CXCR3表达与肿瘤浸润有直接关系，为ACT筛选新抗原特异性T细胞提供了一个功能参数。

01新抗原特异性CD8 T细胞在结构和功能上的异质性

新表位通常被认为是典型的肿瘤排斥抗原。然而，目前尚不清楚它们的临床相关性是否仅源于它们的肿瘤特异性，或者它们是否真正驱动比TAA更好的效应性T细胞。为了了解更多，这里建立了一个识别19个新抗原、TAA和病毒表位【EAAGIGILTV，EVDPIGHLY，LPQARRILL，ITDQVPFSV，GLYDGMEHL，QSDNGLDSDY，GLQAILVHV，KQWLVWLFL，GRKLFGTHF，PYMFLSEWI，KVLEYVIKV，VLVCVLVAL，NILDAIAEI，AMDLGIHKV，GILGFVFTL，GLCTLVAML，VSDGGPNLY，NLVPMVATV，IPSINVHHY】的371个CD8 T细胞克隆，来自16名黑色素瘤、卵巢癌、肺癌或结直肠癌患者和6名健康献血者，并分别研究了190个和338个克隆中TCR的功能和结构特征(图1a)。抗原特异性细胞用双荧光可逆pMHC多聚体(即NTAmers)进行分选，避免了高亲和力细胞的选择性损失。

图1 新抗原、TAA和病毒特异性CD8 T细胞的结构亲和力。

首先评估了T细胞结构亲和力，即TCR与同源pMHC结合的强度。这是通过单体pMHC和TCR的解离动力学(pMHC-TCR半衰期，T1/2)确定的。简言之，可逆pMHC多聚体向pMHC单体的快速衰变允许测量CD8 T细胞的荧光单体pMHC的解离速率。在大多数患者或供体中检测到针对任何类别的单个表位的多克隆应答，在识别每一类抗原特异性中的相同表位的克隆中T1/2有显著差异(图1b，c)。总体而言，新抗原特异性CD8 T细胞的结构亲和力高于TAA特异性CD8 T细胞的结构亲和力(图1d)。当只检查HLA-A*0201限制的CD8 T细胞(图S1a)或独特的CDR3序列(图S1b-c)时，也得出了类似的结论。这支持长期以来提出的假设，即新表位特异性TCR比针对“自身”肿瘤抗原的T细胞具有更高的结构亲和力。

图S1 新抗原、TAA和病毒特异性CD8 T细胞的结构亲和力。

通过IFNγ ELISpot评估每个克隆的抗原敏感性，测量half-maximal T细胞活化所需的肽浓度(EC50，图S2a，b)。与pMHC-TCR T1/2相似，观察到识别每类抗原相同肽的不同克隆之间的EC50存在重要差异，包括HLA-A*0201限制性T细胞应答(图S2c-e)或遗传独特的克隆型(图S2f，g)。正如所预期的，在T1/2和EC50之间观察到正相关，尽管有一些可变性。与功能性分析相比，将后者归因于通过pMHC-TCR解离动力学获得的更具重复性和可靠性的测量，功能测定也依赖于T细胞内在的调节机制。为了进一步测试结构亲和力参数的可重复性，将六个TCRαβ链克隆到健康外周血T细胞中；与抗原敏感性相反，原始T细胞和受体T细胞之间的结构亲和力测量值保持更加一致，在克隆之间保持相似的等级。这支持了结构亲和力作为生物物理参数来描述T细胞的稳健性。

图S2 新抗原、TAA和病毒特异性CD8 T细胞的功能亲和力。

使用体外pMHC复性测定法来验证每个肽对同源HLA等位基因的预测亲和力。pMHC亲和力的总体范围排除了由于低肽-MHC相互作用导致的抗原敏感性测量中的任何重要偏差。突出了用于预测表位免疫原性的常用算法的局限性，发现测量的结构亲和力(或抗原敏感性)与pMHC亲和力、稳定性或加工的计算机预测因子之间的相关性很差，主要依赖于抗原呈递的确定(图1e)。然而，结构亲和力与PRIME预测的免疫原性和pMHC自身异种(DisToSelf)显著相关(图1e)，当排除病毒表位时和当仅考虑遗传上独特的克隆型时也显著相关。PRIME不仅考虑了肽与给定MHC的结合能力，还整合了其被TCRs识别的倾向。DisToSelf确定给定肽与人类蛋白质组的相似性(或差异性)。具有高DisToSelf评分的肽被更高亲和力的T细胞识别(图1e)。

02高结构亲和力新抗原特异性CD8 T细胞驻留在肿瘤中

鉴于已知肿瘤表位TCR亲和力的异质性，询问TCR强度是否区分具有肿瘤浸润性倾向的细胞。事实上，如果较高亲和力的细胞携带抗肿瘤反应，它们将在肿瘤微环境中富集。值得注意的是，在黑色素瘤、卵巢癌、结直肠癌和肺癌患者中，识别新抗原或TAA表位的TIL表现出比识别相同表位的同源外周血淋巴细胞(PBL)显著更高的抗原敏感性(图S5)。

为了评估抗原敏感性的差异是否可以归因于TIL和PBL克隆的结构亲和力属性(图2a)，分析了来自TIL或PBL的7对肿瘤特异性T细胞。发现在所有研究的癌症中，TIL的结构亲和力显著高于同源PBL(图2b，c)。因此，浸润肿瘤的抗原特异性T细胞，特别是新抗原特异性克隆，表现出比它们的血液同类细胞更强的结构亲和力，包括当考虑到遗传独特的克隆型时(图2d)

图2 结构亲和力与肿瘤趋向性的关系。

图S5 新抗原和TAA特异性CD8 PBLs和TILs的抗原敏感性。

为了更好地了解TIL在高亲和力细胞中的相对富集情况，对分选的原始CD8 PBL和TIL的TCR进行测序，并识别了来自患者Lung1的UTP20蛋白的相同新表位。新抗原特异性T细胞是寡克隆的，但PBL和TIL之间只有3个TCR共享(图2e)。值得注意的是，clonotype5在TIL中占主导地位(占新表位特异性细胞的58.8%)，仅占PBL谱系的1.4%，而clonotype1在TIL中较少(9.6%)，在PBL中占主导地位(26.1%)，而clonotype3在TIL(17.2%)和PBL(16.2%)中出现的频率相似。有趣的是，UTP20特异性TCR(图2f)的结构亲和力与它们在肿瘤隔室中的频率相关，并且在clonotype5中最高，表明肿瘤驻留克隆具有更高的结构亲和力(图2g)。TCR和pMHC的分子建模可以准确地推断它们相互作用的强度。在这里，证实了clonotype5的TCR与UTP20 pMHC建立了比clonotype1的TCR更有利的相互作用(图2h和表S3)。在患者CRC1的PHLPP2特异性TCR中也获得了类似的结果，证实了结构亲和力和肿瘤驻留之间的关联(图S7a-d)。这些观察表明，高亲和力克隆和低亲和力克隆分别在肿瘤和血液中优先积累，在来自相同抗原特异性库的克隆型之间也是如此。

表S3 模拟复合物中pMHC-TCR结构亲和力和TCR pMHC相互作用

图S7 针对同一新表位的PBL和TIL克隆型的结构亲和力。

为了实验验证高结构亲和力T细胞(图3a)对肿瘤浸润的优势，利用了一组具有高(DMβ)、中(WT)和低(V49I)结构亲和力的NY-ESO-1 157-165特异性TCR。它们的亲和力涵盖了病毒、新抗原和TAA特异性T细胞范围。用DMβ、WT或V49I TCR稳转HLA-A*0201捐赠者的CD8 T细胞，并分析它们的结构和功能亲和力(图3b)。与V49I转导的T细胞不同，WT和DMβ变体在体外对表达NY-ESO-1的Me275黑色素瘤显示出同等的反应性(图3b)。在携带Me275肿瘤的IL-2 NOG小鼠中，5×10^6 T细胞表明体内疗效与TCR转导的T细胞的结构亲和力有关，而与功能亲和力无关(图3c)。在ACT后，与V49I和WT转导的细胞相比，DMβ转导的CD8 T细胞对肿瘤的浸润显著改善(图3d)，证实了高亲和力克隆的更高的植入倾向。

图3 高亲和力克隆的肿瘤浸润与CXCR3的表达有关。

03CXCR3介导的肿瘤浸润与高亲和力T细胞调控

在建立T细胞亲和力和肿瘤归巢之间的关系后，假设高亲和力的细胞可能被赋予更好的肿瘤浸润和驻留能力(图3a)。几项研究报告表明，关键的趋化因子受体，特别是CXCR3，可能是肿瘤归巢所必需的。分析了一组趋化因子受体在7对低亲和力和高亲和力抗原特异性CD8 T细胞上的表达。与低亲和力T细胞克隆相比，CXCR3在短期刺激后高亲和力T细胞克隆表达和上调更强(图S8a)。这种观察是肿瘤归巢相关分子特有的，因为没有发现与肿瘤浸润无关的趋化因子受体的显着差异(例如CCR7)。除了CXCR3、CD103和CD49a(VLA-1)外，与组织驻留表型相关的两个主要整合素在高亲和力克隆中都上调(图S8b)。因此，T细胞结构亲和力与CXCR3的表达有关，在较低程度上与CD103和CD49a的表达有关。

在体外pMHC刺激下，相对于V49I或WT转导的T细胞，DMβ上也观察到更高的CXCR3表达(图S8c)。有趣的是，在携带Me275黑色素瘤的IL-2 NOG小鼠进行ACT后添加anti-CXCR3抗体，已知表达CXCR3配体，即DMβ转导的T细胞(图3a)，显著损害肿瘤控制(图3e)。一贯地，在ACT后用anti-CXCR3封闭抗体治疗的动物中观察到CD8 T细胞密度较低(图3f)。在使用新抗原特异性TCR的另外两个模型中，进一步证明了通过阻断CXCR3来抑制ACT后的肿瘤控制(图S8d，e)。这证实了CXCR3在肿瘤归巢中的作用，并从机制上将CXCR3的表达与高亲和力克隆和肿瘤浸润联系起来。

图S8 CXCR3、CD103和VLA-1(CD49a)高亲和力克隆的表达及CXCR3介导的肿瘤控制。

04移植入肿瘤的肿瘤特异性T细胞的生物物理化学推断

上述发现共同表明，肿瘤浸润性淋巴细胞富含具有高亲和力TCR的肿瘤特异性T细胞克隆。针对给定的pMHC的T细胞克隆的抗原敏感性的差异与pMHC-TCR结合的强度有关，特别是通过分子建模推断的TCR和pMHC之间的原子接触数，试图开发更多的方法来推断给定表位的克隆的亲和力(图4a)。使用同源建模来比较识别相同pMHC的TCR与应用于5种不同抗原的高或低结构亲和力。根据其α和β链以及同源pMHC的建模结构，每个TCR与其同源pMHC的有利相互作用(键)的数量在高结构亲和力的TCR中一直较高(图S9a和表S3)，并与pMHC-TCRT1/2(图S9b)显著相关。

图4 ACT后肿瘤的浸润与TCR聚类分析所预测的结构亲和力相关。

图S9 预测的高、低结构亲和力克隆的分子模拟。

鉴定临床相关T细胞的一个主要限制是缺乏对可能的同源抗原的了解。为了解决这个问题，这里假设高亲和力的TCR可能共享共同的序列特征(图4a)。此外，据报道，TIL中频繁出现的克隆可能不是肿瘤特异性的。为了克服这些限制，并在上述分子模拟结果的推动下，询问是否可以在不事先知道其特异性的情况下，基于它们的序列分析来推断特定的高结构亲和力TCR。这里选择了58个单独的TCR，识别12个不同的pMHC，其中TCRα和β序列以及结构亲和力是已知的，并寻找结构模式。使用了基于Atchley因子编码的k-mers的生物物理特征和通用的等级聚类算法。发现，高亲和力TCR(T1/2＞60s)的CDR3β序列比低亲和力TCR显著富含特定氨基酸残基(即N、E、I、K、T、Y、V)。相反，A、R、D、L、M和P在低亲和度TCR中出现的频率更高(图S10和表S5)。

图S10 高结构亲和力和低结构亲和力TCR的氨基酸频率。

表S5 用于聚类分析的高亲和力(＞60s)和低亲和力的CDR3β TCR中的氨基酸频率

基于CDR3β TCR序列开发了层次聚类，有趣的是，确定了一个富含具有高结构亲和力的热点，与它们的靶标无关(图4b，黑框虚线)。这占所有中高亲和力的TCR(T1/2＞10s)的62%，而在这个簇外，65%的TCR的结构亲和力＜10s。在1000个随机聚类的对照分析中没有观察到这种富集，说明了这一观察的重要性，并表明一些共同的CDR3β TCR特征优先与更高的结构亲和力相关。

在这一观察的指导下，推导了一个基于结构的Logistic回归模型来预测未知特异性的TCR的结构亲和力(图4a)。将其应用于58个TCR小组，能够准确地区分高亲和力和低亲和力TCR，AUC为0.96，在全部TCR中只有一个假阳性和一个假阴性高亲和力(灵敏度为0.91，特异性为0.97)。在病毒多肽、TAA和新抗原以及不同的HLA等位基因上成功地进行了三个交叉验证方案，以评估预测因子的稳健性，遵循标准的20%排除方案(交叉验证1和2)以及更具挑战性的留下一个表位的交叉验证(交叉验证3)。在所有情况下都取得了高于70%的成功率，这还有改进的余地，但明显好于随机。这一模型的相关性和适用范围将需要进一步研究，很可能会通过纳入更多的实验数据来增加时间。未来，将收集更多的实验数据，预测指标将包括更多的CDR和残基。

应用基于结构的Logistic回归来鉴定另外4名黑色素瘤患者的血液和肿瘤中的高亲和力和低亲和力TCR。当分析总的肿瘤和血液TCR库时，一致地发现TCRs在肿瘤中相对于血液具有高亲和力(图4c)，因此验证了高亲和力TCRs的优先肿瘤趋向性。此外，还在患者Mel8的富集TIL中发现了2个针对新抗原KIF1B S918F的TCR。在2个KIF1B S918F TCR中，尽管功能亲和力没有差异，但通过Logistic回归预测TCR#1具有高亲和力，而TCR#2被预测为低亲和力，这些预测得到了实验验证(图4d)。然后，利用自体肿瘤细胞的可用性来评估2个KIF1B S918F TCR的相对临床疗效。尽管这两个TCR在体外都是肿瘤反应的，但在携带自体肿瘤的小鼠中，通过使用预测和验证的高亲和力TCR转导T细胞而不是低亲和力TCR的ACT，完全可以实现肿瘤控制(图4e)。这个典型的例子说明了高亲和力细胞的优先肿瘤渗透和控制，即使它们以相同的新表位为靶点，但也强调了Logistic回归预测临床相关TCR的临床相关性，而不考虑其特异性。

总结

这里将新抗原识别、T细胞功能和浸润和驻留在肿瘤中的能力联系在一起，这表明新抗原特异性T细胞的临床相关性不仅与其肿瘤特异性有关，还与其更高的功能和侵袭肿瘤的优先能力有关。肿瘤特异性CD8 T细胞是高度异质性的，结构亲和力的测量可以用于更好地选择临床相关的T细胞，避免使用功能较差的克隆型，TAA和新抗原特异性T细胞都是如此。因此，高亲和力T细胞(即优先选择TIL)应优先用于个体化治疗，包括基于TCR的免疫治疗。

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