复杂液体制剂的必修课：评价中的群体生物等效性研究

引言/ Introduction

复杂制剂的质量评价是做好产品的基础，群体生物等效是FDA建议的评价方法之一，CDE也逐渐将其纳入一些多相复杂体系的质量评价。究竟哪些剂型需要用到，又如何开展评价，一起看看小编找到的保姆级教材。

基于推土距离（EMD）算法的群体生物等效性统计方法评价眼用乳剂粒径分布的一致性

徐千姿1，梁月茹1，赵忠卫2*, 沈 雁1**（ 1中国药科大学药学院药剂系，南京210009；

2深圳奥祺生物医药有限公司，深圳518057）

关键词 推土距离；群体生物等效统计分析方法；粒径分布

中图分类号 R944 文献标志码 A 

文章编号 1000 -5048（2022）06 -0698 -07

doi：10. 11665/j. issn. 1000 -5048. 20220608

近年来，随着物质生活水平的提高，人们的健康意识也不断增强，药品需求随之越来越大。仿制药是医疗保障系统中的重要组成部分，其价格相对低廉，拥有良好的经济效益和社会效益[1]。生物等效性（bioequivalence, BE）是批准仿制药的重要步骤之一[2]。体外生物等效性研究是BE研究的重要组成部分，它通常有两种统计分析方法，平均生物等效性（average bioequivalence，ABE）和群体生物等效性（population bioequivalence，PBE）[3]。PBE计算方法最早由安德森和霍克提出[4]，是对ABE方法的补充，这是由于在实际中有许多药物可能存在方差非齐性，相比于ABE检测只比较药代动力学参数的平均水平，PBE统计方法还考虑了参比制剂和受试制剂样本间、样本内所有变异，计算更加严谨[5]。

PSD通常用直方图表示，通过粒子大小和范围的信息可用于描述一些物质物理和化学特性。PSD的分析在建立复杂药品的BE方面已引起了广泛的关注，在FDA官方指南中已建议使用PBE方法对多种纳米制剂的粒径开展体外生物等效性研究，如氢氧化铁蔗糖复合物注射液[6]、二氟泼尼松眼用制剂[7]、盐酸多柔比星脂质体注射剂[8]、妥布霉素/地塞米松眼用悬浮液[9]。对于这些制剂，PBE考察主要参数D50、Span或多分散性系数，其中D50指有一半的粒径直径分布小于该值，Span值用来描述分布的区间，但这些参数只局限于粒径分布是单一峰的情况[10]，当PSD图形是复杂的(即非单峰)，D50/SPAN将不足以进行分析。例如，对于存在双峰的PSD图形，D50可能位于两个峰之间的谷从而导致误差。针对这一问题，FDA在《Draft Guidance on Cyclosporine》[11]中提出了一种度量方法，称为推土距离（Earth Mover’s Distance，EMD）。目前在计算机领域，已有不少研究将EMD算法应用于图像检索、分析和模式识别等[12-13]。EMD定义两个直方图之间的距离为一个运输问题，可用于度量两个相似分布间的差异[14]，因此可将EMD应用于PSD图形相似度比较，为进一步评价粒径生物等效性提供数据基础。 

Restasis于2002年被FDA批准在美国上市用于干眼症的治疗[15]，获得了良好的疗效，但市场上很少有其仿制制剂，其中一个关键挑战是生物等效性研究[16]。本研究以Restasis作为研究对象，应用基于EMD算法的PBE统计计算软件，检验开发的软件是否能通过参比制剂自身等效，并评价不同工艺下受试制剂粒径分布与参比制剂是否具有等效性，本项研究不仅是此环孢素眼用乳剂开发中控制体外生物等效性的关键一步，同时也为其他乳剂、胶束、脂质体、纳米粒、微球、纳米囊等复杂仿制制剂的PSD及PBE评价提供参考。

1、材 料

1.1、药品与试剂

参比制剂（规格0.4 mL:0.2 mg，商品名Restasis，美国Allergan公司）；甘油（南京化学试剂股份有限公司）；蓖麻油[罗辅医药科技（上海）有限公司]；聚山梨酯80（南京威尔药业股份有限公司）；卡波姆共聚物A型（美国Lubrizol公司）；氢氧化钠（西陇科学股份有限公司）；环孢素（浙江瑞邦药业股份有限公司）。

1.2、仪 器

电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；pH计（瑞士Mettler toledo公司）；恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；动态光散射仪（Malvern nano ZSE，英国马尔文仪器有限公司）；Wiggens高速剪切机[维根技术（北京）有限公司]。

2、方 法

2.1、EMD算法

2.2、群体生物等效性

2.3、环孢素眼用乳剂的制备

2.3.1、处方

参考原研制剂处方组成，拟制备三批0.05%CsA眼用乳剂，处方量为100g。根据前期实验结果，改变蓖麻油及、吐温用量及制备工艺参数，以获得不同粒径大小及分布的制剂。

2.3.2、制备工艺

按照表1中处方组成及用量，用20%注射用水分散卡波姆共聚物A型，作为水相1；另取70%注射用水作为水相2；将蓖麻油、聚山梨酯80、甘油、环孢素搅拌溶解均匀后作为油相；油相与水相2混合，在45℃条件下按表2工艺参数以高速剪切制备初乳，而后加入水相1，调节溶液pH至6.0~8.0，加注射用水至终重后即得终乳。

2.4、EMD-PBE统计方法

对给定的参比制剂和受试制剂PSD数据集，首先对所有参比样本PSD求取平均值来得到平均参比样本PSD，作为参比中心。然后应用EMD计算单个参比样本的PSD到参比中心的距离，如[，.....， ，.....]，表示单个参比样本与参比中心之间的偏差。同样地，利用EMD计算每个受试样本到参比中心之间的距离，如[，.......，，......]，表示单个受试样本与参考中心之间的偏差（其中i、j、k分别表示批次、样本数、重复测量次数）。随后，利用PBE对两组EMD进行统计检验，以建立受试制剂和参比制剂之间的BE（见图1）。利用PBE处理一个多层次的数据结构(即，批次×样本×重复测量次数)。相比于直接比较两组PSD曲线，本文中所使用的方法通过计算EMD降低数据的维度，由此绕过多变量比较，并且比较了受试和参比之间的差异与参比内部的差异，所得粒径等效性结果具有真实性。

在此项研究中，采用动态光散射仪，以25 ℃，测量角度173 ℃条件测定制剂粒径；所有样品均用超纯水稀释10倍后置于DTS0012样品池中。每批参比制剂取3个样本，每个样本重复测定5次。按照以下流程进行粒径PBE计算。

Figure 1  Schematic diagram of the proposed equivalence approach

3、实验结果

3.1、参比制剂内部等效性结果

在本节中，在4批参比粒径数据集中任选2批作为R（R：参比样本），其余2批作为T（T：受试样本），以检查所提出的方法接受等效产品的能力（例如，参比制剂本身）。图2-A显示了将参比制剂与自身进行比较的测试结果。可以看出，两个粒径分布图是重合的，有一些局部的变化，这表明即使参比制剂本身也存在一定程度的变化。然后将所提出的方法应用于选定的两组数据。图 2-B显示了参比样本粒径分布图（橙色）和受试样本粒径分布图（青色）到参比中心（即参考样本的平均值）计算的EMD距离。可以看到两组距离具有相似的范围（即低于0.28）。最后，将PBE应用于两组EMD距离，根据判别标准，当＜0.1时，选用常数标准，即=-0.01912＜0。参比制剂自身通过生物等效性验证，由此说明本研究应用的基于所述方法开发的软件是可靠。

Figure 2 Comparison between two sets of the reference samples (two lots) by treating one of them as Test. A：The statistical summary of two groups of the PSD profiles, where the bold curve refers to the mean, flanked by the dotted standard deviation curves；B：The calculated EMD distances of reference (orange) and Test profiles (cyan) to the reference center.

3.2、受试制剂等效性结果

实验中，制备了不同处方用量和工艺参数的受试制剂，按照上述参数测定粒径，获得3个受试制剂数据集，同时以4批参比粒径数据参比数据集，分别应用EMD-PBE统计软件进行分析。图3中A-C分别表示处方F1-F3与参比制剂的PSD分布图；D-F表示处方F1-F3与参比制剂EMD计算结果，可以看出，处方F1，F2与参比制剂的PSD是不同的并且两者EMD的范围也有很大的差异，同时计算结果显示两者均满足＜0.1，分别为0.005102和0.03599，均大于0，故未通过BE测试，由此也说明该方法具有良好的拒绝不等效产品的能力。处方F3通过BE测试，满足＜0.1，=-0.01020＜0。受试制剂F1-F3处方用量及工艺参数的改变对粒径大小及粒径等效性均产生影响，借助EMD-PBE统计分析方法，为仿制药开发中处方和工艺筛选提供一定的帮助。

Figure 3 Comparison between the reference samples and test samples (F1-F3). A-C The statistical summary of two groups of the PSD profiles, where the bold curve refers to the mean, flanked by the dotted standard deviation curves. D-F The calculated EMD distances of reference (orange) and Test profiles (cyan) to the reference center. A-C and D-F corresponded to test preparations F1-F3, respectively

Table 3 Calculation results of equivalence parameters of test and reference preparations 

4、讨 论

EMD是衡量图像之间相似性的有效方法，虽广泛应用于计算机视觉应用，但使用EMD来比较PSD等效性是未曾有过的。本研究团队应用基于Python语言开发的EMD-PBE统计分析软件，操作简单快捷，且从上述结果可知该分析方法可有效通过粒径等效产品，拒绝不等效产品，为仿制制剂处方及工艺开发提供指导。

基于EMD的体外群体生物等效性的统计分析中，仍有部分方面可进一步研究：一是研究对象的选择，二是样本量的确定。本研究案例环孢素眼用乳剂粒径范围广泛[18]（从几纳米到几十微米不等），导致其PSD非完全单峰，故应用该统计方法分析PSD是准确且可信的。在后续研究中，可选择更多其他呈现复杂粒径分布的纳米制剂应用该体外BE评价方法。FDA 在布地奈德吸入剂草稿中指出样本数量应选择不少于受试制剂和参比制剂各3个批次，每个批次10个的样品数（即≥30 个样品）进行统计分析，并且每个样本进行3个阶段（包括制剂寿命初期、中期和末期）的研究，但是Chow等[19]认为 30 个样品数并不足以达到期望功效（80%），提高功效的方法有增加样品量或对于每个样品重复测量，目前对于样品量的计算暂无特定的指导标准。本实验中，由于参比制剂数量受限，故对每批参比制剂的每个样本重复测定5次以提高功效，此外结合Hu等[10]的计算，笔者认为这里的生命周期可以理解为重复测定次数。

参考文献：                 

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