科研丨BRAIN BEHAV IMMUN: 生命早期微生物群破坏影响行为、神经免疫功能和神经发育的关键窗口期

编译：微科盟煎蛋

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

大量研究强调了肠道菌群在生命早期的重要性及其在调节神经发育和行为中的作用。流行病学研究表明，生命早期接触抗生素会增加个体患免疫和代谢疾病的风险。此外，临床前研究表明，生命早期长期抗生素诱导的微生物破坏可能对生理、脑功能和行为产生持久影响。然而，这些研究尚未调查抗生素诱导的微生物群消耗在关键发育窗口期的影响，以及这可能与神经发育结果的关系。本研究通过在三个假定的关键窗口期(出生后(PN；P2-9)、断奶前(PreWean；P12-18)或断奶后(Wean；P21-27))给小鼠给药广谱口服抗生素混合物(氨苄西林、庆大霉素、万古霉素和亚胺培南)来解决这一知识空白，并评估了其对后期生理和行为的影响。研究结果表明，生命早期有针对性的微生物群破坏对盲肠微生物群结构和功能有持久影响，特别是在断奶期间的抗生素暴露。此外，还发现生命早期的微生物破坏选择性地改变了循环免疫细胞，并改变了青春期的神经生理学，包括前额叶皮层中髓磷脂相关基因表达和杏仁核基底外侧小胶质细胞形态的改变。还观察了微生物群消耗对青春期和成年期焦虑相关行为结果的性别和时间依赖性影响。抗生素引起的微生物破坏对社会行为的影响有限而微妙，对抑郁样行为、短期工作或识别记忆没有任何显著影响。综上所述，本研究强调了肠道微生物群在发育关键窗口期的重要性，以及针对微生物群的扰动可能对大脑生理和行为产生微妙但长期的影响。  

图文摘要 

论文ID

原名：Critical windows of early-life microbiota disruption on behaviour, neuroimmune function, and neurodevelopment

译名：生命早期微生物群破坏影响行为、神经免疫功能和神经发育的关键窗口期

期刊：Brain, Behavior, and Immunity

IF：19.227

发表时间：2022.12

通讯作者：John F. Cryan，Caitlin S.M. Cowan

通讯作者单位：爱尔兰科克大学

DOI号：10.1016/j.bbi.2022.12.008

实验设计

结果

1生命早期ABX会对生理读数产生性别和时间依赖性效应

动物对ABX干预的耐受性相对较好，可能PreWean组除外。ABX对出生后体重没有影响[天*处理：F < 1](图1B)。相比之下，断奶前小鼠表现出显著的日*处理相互作用[F(2.5，79.9) = 16.6，P < 0.001]。事后分析没有发现处理组之间在任何一天有显著差异[PBonf≥.091]。然而，目测数据显示，ABX组和Veh组断奶前的处理和灌胃均导致从P15(处理第4天)开始体重增加放缓，ABX组持续时间更长(图1C)。在断奶时间点，也存在显著的日*处理相互作用[F(2.4, 115.0) = 3.99, P = 0.015]。然而，在这种情况下，这是由ABX处理的动物在处理开始时明显更小引起的[PBonf = 0.020；随机抽样误差]，尽管到处理的最后一天，这种情况不再存在[P27：PBonf = 0.094]。在断奶组中也存在显著的日*性别交互作用[F(2.4, 115.0) = 81.8, P <0.001]。具体而言，雄性比雌性增重更快[从P24起PBonf < 0.015]，这与该年龄组的预期一致(图1D)。

Postnatal-ABX组青春期和成年期盲肠重量显著增加，但在处理后盲肠重量没有立即增加。PreWean-ABX处理后盲肠重量直接显著增加[F(1,37)= 58.14, P < 0.001]，但这种影响在青春期[F(1,34) = 3.90, P = 0.056]或成年期[F(1,41) = 1.72, P = 0.20]不再显著。无论是在干预后立即测量，还是在青春期或成年期，Wean-ABX导致盲肠重量持续增加。早期ABX对脾脏重量、小肠长度和结肠长度也有性别和时间依赖性影响，这些影响在很大程度上在青春期恢复正常(补充图1B-D)。

图1 实验设计和抗生素干预期间的体重。

A.实验时间表的示意图和抗生素鸡尾酒中使用的抗生素清单。动物在青春期或成年期经历了行为组1(MBT、3C-SIT和NOR)或行为组2(OF、Y-Maze、TST)。B.出生后(Veh: n = 12，ABX: n = 18)、C.断奶前(Veh: n = 9，ABX: n = 10)和D.断奶后(Veh: n = 13，ABX: n = 15) ABX(直线)或Veh(虚线)处理期间的平均体重(±SEM)。处理效果:*P < 0.05，**P < 0.01。缩写：P：出生后一天，ABX：抗生素，Veh：赋形剂，MBT：大理石掩埋试验，OF：旷场实验，3C-SIT：三室社交测试，NOR：新物体识别测试，TST：悬尾实验。

2生命早期ABX诱导的微生物群破坏显著改变了青春期小鼠的盲肠微生物群

生命早期短暂的ABX暴露对肠道菌群产生了显著而持久的影响。与Veh处理的小鼠相比，无论暴露时间如何，ABX处理的小鼠表现出α多样性减少和β多样性改变(图2A-C)。α多样性描述了给定群落的复杂性，包括所代表的物种数量(丰富度)和物种之间的均等性(均匀性)，并在属水平上进行了分析。在微生物丰富度Chao1指数上，无论处理时间如何，ABX处理小鼠所代表的物种数量均显著减少[最小F(1，34) = 32.77，P < 0.001]。通过Shannon分析，ABX处理小鼠的均匀性也显著降低，这在PreWean组和Wean组具有统计学意义，在Postnatal组也有这种趋势[出生后：F(1，32) = 3.67，P = 0.061，断奶前：F(1，34) = 17.19，P = 0.001，断奶后：F(1，34) = 22.37，P < 0.001]。但Simpsons指数无显著差异(图2A)。主成分分析(PCA)也发现了β多样性的显著差异，β多样性描述了群落整体组成的差异。ABX和Veh处理小鼠之间存在显著差异[F(1100) = 39.13，P < 0.001， R2 = 0.26](图2B)。尽管没有统计学意义，但Postnatal-ABX和PreWean-ABX组倾向于靠近Veh处理的对照组，而Wean-ABX小鼠则聚集在离Veh处理的对照组最远的地方，与性别无关[F(2100) = 1.80，P = 0.07]。 ABX暴露的持久影响还反映在特定类群相对丰度的变化上(图2C和补充图2A)。早期ABX对来自8门26科的53个细菌属有显著影响。在门水平上，ABX组在拟杆菌门(Bacteroidota)和Bacillota中表现出明显的变化，这是构成小鼠肠道微生物群90%的主要细菌门。在拟杆菌门中，所有ABX处理组中Parabacteroides的相对丰度持续增加，但所有其他受影响的属在ABX处理后都有所下降。在Odoribacter、UCG-001、拟杆菌属和Rikenella中观察到最强烈和一致的减少，而在Alistipes、Muribaculum和RC9_gut_group中观察到较小的、性别和/或时间特异性影响。显著改变的属大部分来自Bacillota门，但影响在两个方向上都有。例如，ABX处理动物的Anaerostipes、Blautia、Hungatella和Lachnoclostridium(均为毛螺菌科的成员)以及Clostridioides、Erysipelatoclostridium、Flavonifractor和Staphylococcus的相对丰度均显著增加。

另一方面，Acetatifactor、ASF356、GCA-900066575和几个未培养类群在ABX处理后相对丰度下降。值得注意的是，在Bacillota门中观察到处理时间的显著影响，其中在Wean-ABX组中观察到的效应最大，涉及多个属(如Anaerostipes、Blautia、Acetatifactor)。其他门属的相对丰度变化较小。ABX处理后，Escherichia/Shigella、Parasutterella、Akkermansia和Bifidobacterium的相对丰度均增加，且在Wean-ABX组中效果最强。相比之下，ABX处理后Bilophila、Desulfovibrio、Mucispirillum和Candidatus saccharimonas的相对丰度均下降，但具有不同的时间和性别特异性效应。总体而言，生命早期的微生物群消耗对青春期小鼠的肠道微生物群有持久的影响。 使用PICRUSt2对KEGG orthologs (KOs)进行功能分析，揭示了生命早期ABX对肠道代谢模块(GMMs)和肠-脑模块(GBMs)的显著性别和时间依赖性效应，这两个模块分别代表了涉及微生物代谢和肠-脑通信的通路列表(图2D, E，见补充文件1)。总共有56个肠道代谢模块存在显著差异(图2D)。值得注意的是，ABX处理小鼠的微生物群增加了阿拉伯木聚糖、海藻糖、木糖和甘氨酸降解、氢代谢和同型产乙酸菌的潜力，同时降低了乳酸消耗I和亮氨酸降解的潜力，这表明氨基酸、碳水化合物的代谢和基本能量来源的产生存在差异。这些差异在大多数ABX处理组中观察到。与分类学结果一致，Wean-ABX组GMMs变化最多，影响最大，而PreWean-ABX组GMMs变化相对较少。

在26个肠-脑模块中也存在性别和时间依赖性变化(图2E)。在Wean-ABX组中再次观察到最大的效应量，显示出乙酸合成III、谷氨酸降解II和肌醇降解增加。与GMM结果相反，PreWean-ABX组在肠-脑模块中显示出最多的显著变化，尽管其影响程度较小。在PreWean-ABX组观察到的变化包括谷氨酸I＆II、对甲酚和喹啉酸合成水平显著升高。这些数据表明，由于生命早期抗生素诱导的微生物群破坏，肠道微生物群的表型差异可能对编码肠-脑通信所必需的神经活性分子代谢的功能通路产生持久影响。

图2 在关键发育时期早期使用抗生素后盲肠菌群组成的持久变化。

A.青春期小鼠Chao1、Simpson和Shannon熵指数的平均(±SEM) α多样性水平(P45±4)。

B.在出生后、断奶前和断奶期间，使用抗生素(ABX)或赋形剂(Veh)处理的青春期小鼠(P45±4)的β多样性主成分分析(PCA)。ABX显著改变了所有年龄组的β-多样性。热图显示ABX和Veh处理小鼠之间的显著变化：

C.属的相对丰度(按分类顺序，按门分组)，

D.肠道代谢模块(GMMs)和E.肠-脑模块(GBMs)。颜色表示效应大小，蓝色表示在Veh处理的动物中丰度较高，红色表示在ABX处理的动物中丰度较高。样本量：Veh：n = 8-10只小鼠，ABX：n = 10-12只小鼠。

3生命早期ABX诱导的微生物群破坏对循环免疫细胞有微妙但持久的影响

处理后(生命早期)流式细胞术：ABX处理后立即对血液髓系细胞进行分析，发现在 PreWean-ABX和Wean-ABX组中LY6C−, CX3CR1+单核细胞显著减少，性别无显著影响(图3B)。循环粒细胞(SSChi细胞)也因性别和ABX处理而不同，但这些影响仅在Wean-ABX组显著[处理：F(1，30) = 8.53, P = 0.007；性别：F(1，30) = 5.53，P = 0.025；产后处理趋势：F(1，30) = 4.02，P =0.054]。处理后直接对LY6Chi单核细胞或LY6Cmid, CCR2+单核细胞无显著影响。 青春期组流式细胞术：生命早期ABX对青春期血液髓系细胞有细微的影响(图3C)。处理或性别对LY6Chi单核细胞和LY6C−、CX3CR1+单核细胞无显著影响，仅Postnatal组循环粒细胞呈下降趋势。然而，性别与LY6Cmid, CCR2+单核细胞处理之间仅在断奶时间点存在显著的相互作用[F(1，23) = 6.01，P = 0.022]，尽管事后检验并未发现处理对任何性别的显著影响。 成年期流式细胞术：在成年期观察到生命早期ABX对血液髓系细胞的细微影响(图3D)。Wean-ABX组LY6Chi单核细胞显著增加[F(1，42) = 5.04，P = 0.030]，出生后时间点的性别和治疗之间存在相互作用[F(1，32) = 4.27，P = 0.047]，尽管在调整后的事后检验中各组间无显著差异。对于LY6C−, CX3CR1+单核细胞，出生后处理和趋势或性别*处理相互作用有显著影响。LY6C−, CX3CR1+单核细胞在ABX两个时间点均显著增加，但对于相反的性别：出生后的雄性[雄性：P = 0.032，雌性P = 0.99]和断奶期的雌性[雌性：P = 0.013，雄性P = 0.98]。Postnatal-ABX组的粒细胞也显著增加，而在断奶前时间点有显著降低的趋势。最后，LY6Cmid, CCR2+单核细胞在出生后时间点显示出处理效果的趋势[F(1，30) = 4.10，P = 0.052]。综上所述，这些结果表明，生命早期的ABX对髓系免疫细胞运输有微妙但持久的影响。

青春期组血浆细胞因子：对青春期血浆细胞因子水平的分析揭示了特定细胞因子处理的时间和性别依赖效应(图3E)。IFN-γ在Postnatal-ABX组中显著升高[F(1，30) = 9.03，P = 0.005]，在Wean-ABX组中观察到性别和处理之间的显著相互作用[F(1，32) = 4.32，P = 0.046]，尽管在调整后的事后检验中组间没有显著差异。其余对细胞因子水平的影响与性别有关。具体而言，雄性在所有时间点均表现出IL-5水平显著降低，在断奶前时间点KC/GRO水平显著降低，IL-6水平显著或呈下降趋势[出生后：F(1，32) = 3.49，P = 0.071；断奶前：F(1，33) = 12.34，P = 0.001；断奶期：F(1，33) = 3.70，P = 0.063]。另一方面，雄性在断奶前[F(1，34) = 4.70，P = 0.037]和断奶期[F(1，34) = 4.52，P = 0.041]时间点表现出显著较高的IL-1β水平；TNF-α无显著差异。与流式细胞仪结果一致，这些数据表明，生命早期ABX诱导循环免疫细胞发生微妙变化。

图3 生命早期接触抗生素会在处理后直接引起循环免疫细胞的微妙变化，这种变化会持续到青春期和成年期。

A.血流门控策略：根据FSC-height和SSC-height选择细胞。

1)随后选择LY6Chi单核细胞(CD11b+，LY6Chi)，而CD11b+，LY6Clow/-细胞用于选择其他群体。

2)选择粒细胞(CD11b+，SSChi)，3) SSChi，LY6C−细胞用于对LY6C−,CX3CR1+单核细胞(CD11b+，SSClow，LY6C−，CX3CR1+)进行门控，4) SSChi，LY6C−细胞用于对LY6Cmid, CCR2+单核细胞(CD11b+，SSClow，LY6Cmid，CCR2+)进行门控。抗生素(ABX)和赋形剂处理(Veh)的雄性和雌性小鼠(B)生命早期(处理后：P9、P18和P27；Veh：n = 6-10只小鼠，ABX：n = 7-10只小鼠)、(C)青春期(P45±4；Veh：n = 4 ~ 8只小鼠，ABX：n = 8 ~ 12只小鼠)、(D)成年期(P81±4；Veh：n = 7-9只小鼠，ABX：n = 10-16只小鼠)血液中单核细胞和粒细胞的平均(±SEM)水平。E.生命早期暴露于ABX或Veh的青春期小鼠血浆中循环炎性细胞因子的水平(P45±4)。检测下限(LLOD)由填充灰色区域表示。缩写：IFN-γ：干扰素γ，IL-1β：白细胞介素1-β，IL-5：白细胞介素-5，IL-6：白细胞介素-6，TNF-α：肿瘤坏死因子-α。

4生命早期ABX暴露改变了青春期小鼠基底外侧杏仁核的小胶质细胞形态

与之前的研究结果相补充，生命早期ABX不影响小胶质细胞的数量，但显著改变了小胶质细胞的形态(图4A-E)。具体来说，在所有处理时间点，小胶质细胞的复杂性显著增加(交叉点数量增加)(图4D)。此外，Postnatal-ABX组雌性小鼠的体细胞大小显著增加(图4C)，并且在PreWean-ABX和Wean-ABX组中最大分支长度增加(图4E)。这些发现让人想起在GF和ABX暴露动物中观察到的畸形和未成熟的小胶质细胞。总体而言，这些数据表明，即使短期有针对性地破坏发育中的肠道微生物群，也会对小胶质细胞的成熟产生微妙但持久的影响。

图4 早期抗生素暴露改变了青春期小鼠基底外侧杏仁核的小胶质细胞形态。

A.抗生素(ABX)和Veh处理(Veh)的青春期小鼠基底外侧杏仁核中Iba1+免疫组化的代表性显微照片(P45±4)。比例尺分别为50 μm(完整显微照片)和20 μm(插图)。B-E. Iba1+小胶质细胞的Sholl分析测量均值(±SEM)。生命早期ABX不改变小胶质细胞总数(B)，但对小胶质细胞大小有性别和时间依赖性影响。ABX对小胶质细胞的复杂性也有显著影响，包括交叉数(D)和最大分支长度(E)。样本量：Ve：n = 6-7只小鼠，ABX：n = 6-7只小鼠。

5生命早期ABX对青春期小鼠杏仁核和前额叶皮层的基因表达有性别和时间依赖性影响

对青春期杏仁核中涉及神经免疫、神经可塑性、神经肽信号和神经递质受体的基因的分析显示，生命早期ABX处理仅产生轻微影响(图5A)。在评估的8个基因中，只有Bdnf和Il-6基因的表达因早期暴露于ABX而改变。虽然在ABX后两者都被下调，但Postnatal-ABX组对Bdnf [F(1，34) = 4.36，P = 0.044]和Wean组对Il-6 [F(1，35) = 4.58，P = 0.039]的影响显著，更具体地说，在Wean-ABX组雄性中显著。性别对催产素受体的显著影响仅见于PreWean组[F(1，31) = 7.17，P = 0.012]。总体而言，这些数据表明，生命早期的微生物破坏会引起青春期小鼠杏仁核中与神经可塑性和神经免疫相关的基因的微妙变化。然而，这些变化是否转化为蛋白质水平仍有待评估。

肠道菌群此前也被证明参与了前额叶皮层(PFC)髓鞘形成的调节。我们研究了短暂的、靶向的生命早期ABX是否也影响青春期小鼠PFC中髓鞘相关基因的表达，揭示了性别和时间依赖的趋势和相互作用(图5B)。Postnatal-ABX组Mog [F(1，34) = 3.30，P = 0.078]、Plp1 [F(1，33) = 3.33，P = 0.077]、Myrf [F(1，34) = 3.57，P = 0.067]基因表达均有升高趋势，其他基因均无显著影响。PreWean小鼠在Mog [F(1，34) = 5.49，P = 0.025]和Mbp [F(1，34) = 4.09，P = 0.051]表达方面表现出显著或趋势的性别影响，同时在Plp1 [F(1，34) = 5.07，P = 0.031]、Mag [F(1，34) = 7.55，P = 0.010]、Myrf [F(1，34) = 5.02，P = 0.032]、Mbp [F(1，34) = 3.97，P = 0.054]和Sox10 [F(1，34) = 3.62，P = .066]表达方面表现出显著或趋势的性别和处理相互作用。对这些相互作用进行调整后的事后随访并没有显示出对任何性别的显著治疗效果，然而，在所有情况下，与ABX处理的雄性相比，PreWean-ABX雌性的基因表达均有所降低，除了Sox10，其影响处于趋势水平。这种微妙但一致的模式表明，雌性在断奶前可能更容易受到ABX暴露的影响。断奶组在髓磷脂相关基因表达方面没有表现出任何处理或性别的显著影响。总体而言，这些结果表明，即使是生命早期短暂的、有针对性的微生物群消耗，对髓磷脂相关基因表达的影响也很小，并强调了出生后和断奶前的发育时期是微生物影响的潜在窗口期。

图5 生命早期抗生素暴露对青春期小鼠前额叶皮层和杏仁核基因表达的性别和时间依赖性影响。

A-B.抗生素(ABX)和Veh处理(Veh)的青春期(P45±4)小鼠的杏仁核(A)和前额叶皮层(PFC)(B)基因表达的平均(±SEM)水平。生命早期ABX导致PFC中髓磷脂相关基因表达的微妙性别和时间依赖性变化。样本量：Veh：n = 6-10只小鼠，ABX：n = 9-12只小鼠。

6生命早期ABX暴露不会引起幼崽行为的改变

超声发声(USVs)量化显示，生命早期ABX对通过呼叫总数、持续时间、频率或特征来衡量的交流行为没有显著影响(图6A-D)。与这一发现一致，在幼崽找回测试中，母鼠的反应性没有改变(图6E-F)。在母系依恋的归巢测试中，我们观察到各组在母鼠垫具上花费的时间没有差异(图7G)。综上所述，本研究没有观察到产后早期微生物破坏导致母鼠或幼崽行为变化的证据。

图6 生命早期抗生素暴露对幼崽行为的影响。抗生素暴露(ABX)小鼠幼崽在出生后第8天(P)与赋形剂处理(Veh)或未处理的幼崽相比，没有表现出交流缺陷或焦虑样行为，通过平均(±SEM) 

A.呼叫次数(超声发声)、B.呼叫持续时间、C.每分钟呼叫次数和D.呼叫特征衡量。样本量：未处理：n = 28-50只，Veh：n = 30-40只，ABX：n = 35-46只。E-F.在P5的幼崽找回测试中，母体的反应性不受生命早期ABX的影响，通过平均(±SEM) E.嗅第一个幼崽的潜伏期和F.找回幼崽的潜伏期来衡量。样本：未处理：n= 9，Veh：n= 7，ABX：n= 21。G.在P11的归巢测试中，母系依恋表现为中位数和四分位数范围，须表示最小值和最大值，即在母鼠垫具上花费的时间。样本量：未处理：n = 65-69只小鼠，Veh：n = 35-38只小鼠，ABX：n = 46-50只小鼠。

7生命早期ABX暴露对行为结果有微妙但持久的影响

焦虑样行为。在青春期小鼠的旷场实验中，在PreWean时间点，处理[F(1，35) = 7.86，P = 0.008]和性别[F(1，35) = 14.92，P <0.001]对在中心区域度过的时间有显著影响(图7A)。PreWean雌性和PreWean-ABX小鼠表现出较强的焦虑样行为，表现为在中心区域的时间减少。自发活动也受到早期ABX的影响，尽管影响方向相反，这取决于暴露的时间。具体而言，PreWean-ABX小鼠的自发活动显著下降[F(1.34) = 4.70，P = 0.037]，而Postnatal-ABX小鼠的自发活动显著增加[F(1，45) = 4.89，P = 0.032]，而Wean-ABX小鼠的自发活动有增加趋势[F(1，35) = 3.24，P = 0.080]。到了成年期，没有观察到处理对自发活动或焦虑样行为的显著影响(图7B)。虽然在出生后时间点观察到雌性小鼠出现了类似且显著的模式，但仍观察到断奶前雌性小鼠在中心区域花费的时间减少，但这只是一种趋势。 类似地，ABX对大理石掩埋试验中的焦虑样行为和强迫行为有显著但逐渐减少的影响。在青春期，Postnatal-ABX和PreWean-ABX动物都表现出焦虑或强迫样行为的增加，表现为测试中埋珠增多(图7C和补充图3)。到了成年期，ABX的焦虑增加仅在PreWean-ABX小鼠中明显。在所有时间点上，成年雄性比雌性埋珠数量更多(图7D和补充图3)。这些结果表明，生命早期ABX暴露对青春期焦虑样行为的时间特异性影响在成年后基本消除。

社会偏好和认可。在青春期，在所有处理时间内，对社会刺激都有显著的偏好(图7E和补充图3和4)。在断奶组中，刺激*性别和刺激*处理*性别相互作用也存在趋势。后续测试显示，所有Wean组都表现出对社会刺激的偏好，雌雄之间没有显著的刺激*处理相互作用。在青春期的所有处理时间中，也存在显著的社会新颖性偏好，Postnatal组有刺激*处理相互作用趋势，而PreWean组有刺激*性别相互作用趋势(图7F)。在出生后时间点，相互作用趋势是由出生后Veh组缺乏显著的新颖性偏好所驱动的，尽管ABX和Veh处理的动物在与每种刺激相互作用的时间方面没有显著差异。在断奶前时间点，两性均表现出对新奇事物的偏好，并且雄性在新奇刺激上花费的时间有增加的趋势。在成年期，在所有处理时间中再次表现出显著的社会偏好(图7G和补充图3、4)。在断奶前时间点，也有刺激*处理交互作用的趋势和显著的刺激*处理*性别交互作用。后续测试显示，所有PreWean组都表现出社会偏好，而且与Veh处理的雌性相比，PreWean-ABX雌性在社会刺激上花费的时间较少。成年期的社会新颖性偏好在所有处理时间都显著，无显著刺激相互作用(图7H)。综上所述，可以得出结论，生命早期微生物群的破坏对社交有微妙的、时间和性别特异性的影响，对社会认知的影响有限。

图7 生命早期抗生素暴露对青春期和成年小鼠焦虑样、强迫样和社会行为的持久影响。

A-B.抗生素(ABX)和赋形剂处理(Veh)动物在中心区域停留的平均(±SEM)时间和在旷场实验中行进的距离。A.在青春期，断奶前组的雌性和ABX处理动物表现出较强的焦虑样行为(在中心区域的时间减少和运动减少)，而出生后的ABX动物则观察到运动增加。B.成年后，出生后时间点的雌性在中心区域的时间比雄性少，但其他影响不显著。C-D.焦虑和强迫行为被评估为大理石掩埋测试中埋珠的平均值(±SEM)。C.在青春期，ABX暴露增加了出生后和断奶前时间点埋珠的数量。D.成年后，处理效果仅在断奶前时间点观察到。在三室社交测试中，5分钟内的社交能力和社会新颖性偏好，评估为在社交阶段与同一只小鼠或对象互动的平均(±SEM)时间(E, G)和在新事物阶段与同一只(熟悉)小鼠或新小鼠互动的平均(±SEM)时间(F, H)。PreWean-ABX雌性表现出较低的社交性，但只有在成年期测试时才会出现这种情况。生命早期ABX对青春期和成年期的社会新颖性偏好没有显著影响。样本量：Veh：n = 8-11只小鼠，ABX：n = 11-17只小鼠。年龄：青春期(P35-41)，成年期(P68-79)。抑郁样行为。生命早期ABX与青春期(图8A)或成年期(图8B)的长期抑郁样行为(悬尾实验中的静止)无关。然而，我们确实在某些群体中观察到性别的显著或趋势效应，即雌性在青春期和成年期的静止时间往往比雄性更多。

短期记忆和工作记忆。在青春期(图8C)和成年期(图8D)，Y迷宫的空间学习和工作记忆不受生命早期ABX的影响。同样，在青春期(图8E)或成年期(图8F)的新物体识别测试中，没有观察到处理或性别的显著影响。虽然在青春期断奶组中存在处理*性别交互作用的趋势，但后续测试并未显示任何显著的两两比较。总体而言，生命早期微生物群的破坏对抑郁行为或短期记忆没有持久的影响。

图8 生命早期抗生素暴露对青春期和成年小鼠的抑郁样行为、情景或空间工作记忆没有长期影响。

A-B.抑郁样行为，用悬尾实验中静止不动的平均(±SEM)时间来衡量。与赋形剂(Veh)处理相比，生命早期抗生素(ABX)处理在青春期(A)或成年期(B)未观察到显著效果。C-D.通过Y迷宫的自发交替行为评估空间学习和工作记忆。在青春期(C)或成年期(D)未观察到ABX的显著影响。E-F.在新物体识别(NOR)测试中评估识别记忆。在青春期(E)或成年期(F)未观察到生命早期微生物破坏的显著影响。样本量：Veh：n = 7-11只小鼠，ABX：n = 8-15只小鼠。年龄：青春期(P37-49)，成年期(P71-84)。

讨论

定义生命早期微生物群发展的关键窗口及其与大脑的关系正成为一个重要的和转化相关的研究问题。本研究旨在描述在确定的关键发育窗口期间使用抗生素破坏微生物群对微生物-肠-脑轴通信的影响。本研究表明，在三个独立的生命早期窗口期，ABX靶向诱导的微生物群消耗对肠道微生物群具有时间特异性影响，以及对循环免疫细胞和神经生理学(包括前额叶皮层中髓磷脂相关基因表达的改变和杏仁核基底外侧小胶质细胞的畸形)的微妙性别和时间依赖性影响。我们还观察到性别和处理时间对青春期和成年期行为结果的影响。

生命早期接触ABX对盲肠菌群的多样性和组成有广泛而持久的影响。与以往关于长期抗生素处理的报告类似，无论暴露时间如何，生命早期短暂的抗生素暴露与青春期潜在致病菌多样性的显著丧失和大量繁殖有关，包括Escherichia/Shigella、Staphylococcus和Clostridioides。本研究的结果与抑郁症的研究结果也有相似之处。在最近的一项系统综述中，在ABX处理的动物中增加的几个类群，包括Anaerostipes、Blautia、Erysipelatclostridium、Parabacteroides、和Bifidobacterium，这些类群在临床抑郁症患者中也显示出持续增加的相对丰度。另一方面，ABX处理小鼠的主要短链脂肪酸(如乙酸和丁酸)产生菌群Alistipes、Bacteroides、Odoribacter和Lachnospiracea NK4A136减少。SCFAs不仅调节肠屏障功能，还充当肠-脑轴信号传导的关键信使。有趣的是，产生SCFA的类群丰度下降也与炎症状态增加和情绪障碍有关。

与最近的一项研究类似，我们在幼年接触ABX后的青春期小鼠中观察到两种不同的低多样性群落类型。就时间特异性效应而言，我们观察到断奶期ABX暴露对青春期整体微生物群组成的影响最为显著，这表明Wean-ABX组与Veh组聚类最远。此外，Postnatal-ABX和PreWean-ABX动物在ABX处理后仍然暴露在危险中(包括母乳和粪便微生物群)，这可能促进了微生物群的部分恢复。这与ABX的恢复受到基线微生物群组成以及饮食和环境的强烈影响的证据相吻合。总之，本研究提供的证据表明，即使是生命早期短暂的ABX暴露也会对发育中的肠道菌群的组成和结构产生持久的影响。 在本研究的生命早期短暂ABX暴露模型中，我们观察到循环骨髓细胞群发生了微妙的、时间特异性的改变。具体而言，我们观察到LY6C-，CX3CR1+单核细胞在断奶前和断奶期处理后直接显著减少。有趣的是，LY6C-，CX3CR1+单核细胞由LY6Chi单核细胞发育而来，在我们的处理中，LY6Chi单核细胞没有变化，这表明ABX暴露可能会延迟单核细胞分化。

值得注意的是，对无菌(GF)小鼠和ABX处理小鼠的研究已经确定了不同的变化，其中小鼠显示出LY6Chi单核细胞减少。这种差异可能是由于所使用的模型(GF与ABX鸡尾酒)、干预时间和持续时间的差异。作为对GF小鼠研究的补充，我们还观察到处理后循环粒细胞水平直接下降，但仅在断奶组。早期ABX暴露的微妙影响持续到成年，然而，出生后和断奶组表现出LY6C-，CX3CR1+单核细胞水平升高，这表明对生命早期干扰可能有补偿作用。事实上，这些特异性先天免疫细胞对于维持大脑稳态至关重要，肠道-大脑-免疫轴中这些信使的扰动被认为与大脑疾病的发展高度相关。综上所述，这些结果表明，ABX在生命早期诱导的微生物群破坏对循环免疫细胞群有微妙但持久的影响。然而，这些观察到的变化是否对大脑健康和疾病有影响，值得进一步探索。 小胶质细胞是大脑的常驻巨噬细胞，在大脑内稳态的发育、功能和维持中起着重要作用。小胶质细胞在生命早期的活动对神经回路的持久功能和随后的行为发育至关重要。特定时期的潜在扰动使这些免疫细胞成为神经发育敏感时期微生物群衍生信号的中枢介质。先前的研究表明，肠道菌群和微生物来源的SCFA乙酸是皮层小胶质细胞成熟、功能和代谢特性的关键调节因子。扩展这些研究，我们证明了生命早期短暂的ABX暴露具有持久的影响，改变了青春期基底外侧杏仁核的小胶质细胞形态。

具体而言，与Veh处理的小鼠相比，ABX-PreWean和ABX-Wean雄性小鼠的交叉总数显著增加。这种形态表型让人想起在GF和ABX处理的小鼠中观察到的未成熟和畸形的小胶质细胞。基于我们的研究结果和之前的工作，我们推测这些变化可能是由短链脂肪酸(SCFA)乙酸的改变所驱动的。具体来说，最近的一项研究发现，补充醋酸盐可以挽救GF和ABX小鼠中观察到的小胶质细胞缺陷。在本研究中，ABX暴露与拟杆菌门细菌的损失有关，而拟杆菌是醋酸盐的主要生产者。此外，肠道代谢和肠道-大脑模块预测了与乙酸合成相关的功能途径的变化。这些结果表明，生命早期ABX导致的微生物群代谢途径的变化可能会导致小胶质细胞的长期变化。有趣的是，在这项研究中，发现断奶前和断奶期最容易受到早期ABX的影响。这与免疫学文献中的发现相一致，即断奶期特别容易受到免疫损伤和免疫系统微生物群调节的影响。然而，生命早期微生物群扰动对免疫系统、小胶质细胞功能的重要性以及对大脑结构、功能和行为的机制影响仍有待充分了解。 尽管我们基于之前在杏仁核中微生物基因调控的发现分析了一系列基因，但我们干预的影响仅限于与青春期神经可塑性和神经免疫相关的两个基因：Bdnf和Il-6。

例如，Bdnf表达的改变是微生物-肠道-大脑轴紊乱的标志，并且在无菌、抗生素耗尽、抑郁和神经发育障碍的模型中也观察到这种改变。此外，促炎Il-6表达增加与自闭症、焦虑样行为和抑郁行为有关。总的来说，这种微妙的变化可能是由于处理的时间限制和我们干预期间大脑的可塑性，允许在青春期部分恢复。 研究还表明，肠道菌群紊乱的动物前额叶皮层中髓磷脂相关基因发生了改变。生命早期的微生物消耗有微妙的影响，特别是在出生后和断奶前的发育时期，这表明微生物影响的一个潜在窗口。有趣的是，与ABX处理的雄性相比，PreWean-ABX处理的雌性表现出髓磷脂相关基因表达减少。虽然这些基因表达的变化是否转化为蛋白质水平的改变或髓鞘形成的超微结构变化仍有待观察，但我们的结果符合微生物群的预测功能分析。有趣的是，肠-脑模块分析预测了断奶前对甲酚(酪氨酸的代谢物)的变化。研究发现，这种代谢物浓度的增加会减少髓鞘形成，并与社交和自闭症样行为有关。在本研究中，预测对甲酚的增加可能归因于产对甲酚属Clostridioides和Anaerostipes，它们在断奶前雌性中相对丰度增加，但在雄性中没有。

同样，4-ethylphenyl sulfate是Clostridioides产生的另一种微生物代谢物，也在ASD患者中检测到，最近与焦虑样行为和大脑中的髓鞘模式有关。这些代谢物是肠-脑轴信号的关键调节物，提供了一种潜在的途径，将肠道微生物群组成的变化与髓鞘形成和随后的行为改变联系起来。重要的是，以往绝大多数涉及肠道菌群调节脑功能的研究都使用了无菌小鼠或长期ABX诱导的菌群耗损。然而，在这项研究中，我们使用了短暂而有针对性的ABX暴露，强调即使是生命早期微生物群组成的短期变化也可以通过调节特定发育窗口期间的髓磷脂动力学对脑神经生理学产生微妙但持久的影响。 尽管ABX对肠道菌群有重大而持久的影响，并有一些微妙的外周和中枢生理影响，但生命早期的短期处理对早期行为的影响有限。与之前在其他生命早期微生物群扰动模型(如剖腹产/母体ABX)中的结果相反，我们没有观察到在交流行为或社会依恋学习方面的任何缺陷。具体来说，我们之前发现，母亲接触广谱抗生素鸡尾酒会导致社会依恋学习缺陷，然而，单独服用青霉素V没有影响。此外，剖腹产出生的幼崽被发现在交流行为和社会依恋学习方面表现出缺陷，这些缺陷在服用双歧杆菌后完全恢复。综上所述，这些结果表明，生命早期特定的肠道微生物群落可以对生命早期行为产生不同的影响，因此值得进一步研究。 此外，本研究发现ABX-PreWean处理的雌性表现出较强的焦虑样行为。虽然肠道菌群衰竭在焦虑样行为中的作用存在争议，最近的证据强调了髓磷脂动力学改变和大脑连接在行为神经科学中的重要性。因此，在PreWean雌性中观察到的细微变化可能是由于神经生理学的改变，这是合理的，然而，需要进一步的研究来证明这一点。

有趣的是，与成年期相比，青春期的有限行为变化更为明显。这表明，生命早期接触ABX会引起微妙的行为影响，这些影响可能在成年后部分恢复。这与先前的研究一致，这些研究表明，由于早期微生物破坏而导致的焦虑样行为的变化在青春期观察到，而在成年期则没有。此外，ABX暴露对社会行为的影响有限且微妙，对抑郁样行为、短期工作或识别记忆没有任何显著影响。事实上，需要进一步的研究来了解这些结果的分子基础，并确定由于生命早期ABX导致的微生物群组成的持久改变是否会增加个体对二次打击的易感性以及随后发展为神经发育或神经精神疾病的风险。行为变化的微妙之处表明，即使是旨在在生命早期大量破坏微生物群的广谱多药抗生素治疗，对行为的长期影响也有限。虽然我们的方案是专门为回答生命早期微生物群消耗是否对肠-脑轴和神经发育有长期影响这一基本问题而设计的，但这些发现的转化相关性值得考虑。临床处方的抗生素处理在本质上通常更具针对性，因此预计对微生物组的影响更有限，进而对行为的影响也更有限。然而，一些常用的儿科抗生素(如甲硝唑)可以穿过胃肠道和血脑屏障，因此可能对神经发育结果产生更直接的、潜在的不依赖于微生物群的影响。因此，评估儿童和婴儿期临床相关处方对微生物-肠-脑轴的影响至关重要。在尝试转换此处确定的关键窗口的时间时，也应谨慎。在神经发育方面，啮齿动物生命的第一周通常相当于人类怀孕的最后三个月，而第二和第三周分别被认为大致相当于人类的婴儿期和儿童期。然而，在考虑如何转译肠-脑轴的微生物群、免疫系统和其他组成部分的发育时，存在一些并发症。

未来的工作应该将我们的实验扩展到：

1.了解生命早期微生物群干扰对后期精神病理学的临床意义；
2.梳理出微生物群的重要性，这些微生物群在生命早期扰动后有不同的表现。这些研究将使我们能够充分阐明靶向微生物-肠-脑轴信号传导关键窗口的治疗潜力。
综上所述，本研究为生命早期肠道微生物群与神经发育结果之间的联系提供了几个重要的新见解。展示了在三个不同的假定发育脆弱性关键窗口期间微生物群破坏的长期后果。本研究结果表明，生命早期微生物群的破坏可能会通过改变肠-脑轴信号的关键神经调节因子，微妙地影响长期的大脑功能和行为。