肠道微生物与结石的形成

肾结石是一种复杂的且全球流行的疾病，受基因和环境因素的影响。成对的研究显示结石的遗传风险大概为56%，然而其他的影响风险包括：饮食、运动、工作环境和地理。最近这些年，肠道微生物体系影响尿液组成的作用也导致了有数据显示：它们也会影响肾结石的发生率。大约75%的肾结石主要由草酸钙构成，尿草酸被认为是一个重要风险因素。微生物体系在肾结石的形成机制和预防都有重要作用，肠道微生物体系在肾脏疾病的作用是最近的研究热点。草酸杆菌属可减少肠道内的草酸盐，并减少尿液中草酸排泄。

肠道微生物指动物肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠动物的肠道生活，同时帮助寄主完成多种生理生化功能。肠道不仅是人体消化吸收的重要场所，同时也是最大的免疫器官，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用。人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，成人肠道内的微生物数量高达10^14个，接近人体体细胞数量的10倍；质量达到1.2kg，接近人体肝脏的质量；其包含的基因数目约是人体自身的100倍，具有人体自身不具备的代谢功能。微生物体系在功能上，在人体宿主细胞中进行各种生物加工。越来越多的人担心“西式”饮食和生活方式已经改变了肠道微生物体系的基因组成和新陈代谢活动。这些细菌总体的改变与一些疾病不断提高的发病率有关:肥胖、冠状动脉疾病、过敏和代谢综合征。这些影响使得肠道微生物体系也影响与肾结石形成相关的溶质的吸收和分泌这一假设成为可能。

到目前为止，关于肠道微生物体系在肾结石的发病机制中的作用知之甚少。最近有一项研究发现了肾结石患者与对照组的肠道微生物体系有显著差异。两组患者的粪便和尿液样本显示有178类菌群属，其中每组中五种最丰富的肠型或不同的细菌群落构成了所鉴定的细菌丰度50%以上。普氏菌属在对照组中含量最丰富，拟杆菌属在肾结石患者组中含量最丰富。 真菌与草酸水平呈负相关，埃希菌属与柠檬酸盐水平呈负相关。结石患者和对照组的细菌丰度差异是导致结石形成的主要因素还是次要因素，就像抗生素使用和饮食的作用一样始终不确定。如此广泛的肠道微生物体系的特性需要更多的研究。

一、基因和微生物特性：

Allison及其同事于1985年发现了一种草酸降解菌Oxalobacterformigenes（Oxf），因其参与草酸钙结石病而备受关注。临床研究提示：机体缺失Oxf与高草酸尿症与草酸结石形成间有直接联系。革兰氏阴性厌氧菌是人类肠道菌群和其他哺乳类动物的正常细菌的一部分。它的独特之处在于它既需要草酸作为碳源也需要ATP的生成。它已经在人类、啮齿动物、狗、猪和牛的肠道被发现。如果存在的话，那么它可降解摄入的草酸，减少肠道吸收，减少刺激结肠草酸分泌，预防高草酸尿。

Oxf的草酸盐代谢需要通过被oxIT基因编码的称为OxlT的膜转运蛋白摄取细胞外草酸盐以换取甲酸盐（参见图1）。frc基因编码甲酰CoA转移酶Frc，其通过添加辅酶A分子以形成草酰-CoA来活化草酸盐。然后将草酰基-CoA脱羧成CO2和甲酸盐，然后用oxlT利用后者以吸收更多的草酸盐。脱羧反应由oxalyl-CoA-脱羧酶催化，由oxc基因编码。质子的向内梯度导致ATP产生。

虽然oxf被认为是最有效的草酸盐降解剂，但其他草酸盐降解微生物群在人体肠道中的作用尚未完全阐明。多种细菌种类同时具有oxc和frc，并且在体外具有草酸盐降解活性。最近，Hatch等人研究表明：乳酸双歧杆菌定殖通过降解膳食草酸盐并减少其在小鼠模型中的肠道吸收来减少尿草酸盐。在一项针对南非男性的研究中，已经确定了乳酸杆菌属具有降解高草酸盐能力。

比较17种Oxf的细胞脂肪酸谱将这些菌株分成两个主要组，目前称为第1组（例如菌株OXCC13）和第2组（例如菌株HOxBLS）。作为人类微生物组计划的一部分，这两个菌株的基因组测序可以增加我们对生物体重要生物学特性的理解。在对数和静止生长期培养物中进行Oxf的额外蛋白质组学分析，可以鉴定对其生长和存活至关重要的特定蛋白质。

基于PCR检测对oxc 和/或 frc基因的特异性发展，允许研究该生物体在草酸盐代谢中的作用。可以高度灵敏和特异性地快速检测粪便培养物和新鲜粪便标本中的Oxf。 测量粪便的草酸盐降解能力是间接确定有机体存在与否和活性的另一种方法。

研究报道了Oxf在正常人体肠道中定殖的程度有很大差异。可能存在检测不到的细菌水平，或者每克粪便可能存在多达107个细菌。 粪便样品中的Oxf水平增加约10倍，饮食草酸盐增加10倍。相比之下，有机体的丰度随着钙摄入量的增加而降低，这会使草酸盐结合并降低其可用性。

我们最近描述了人类微生物组计划（HMP）数据揭示的人体肠道微生物组中Oxf的流行，相对丰度和稳定性[15]。使用全基因组枪（WGS）测序和V13或V35 16S rRNA测序分析来自242名健康年轻成人的粪便样品。 对WGS数据集的分析显示，94名受试者中有29名（31％）是Oxf阳性，而V13和V35数据的分析显示Oxf患病率分别为15％（22/155）和11％（23/210）。

因此，HMP研究人员对Oxf的检测在很大程度上取决于所用的方法：WGS比16S rRNA测序更敏感。我们发现WGS分析中所有29名Oxf阳性受试者都被菌株OXCC13定殖。然而，在这29个中，59％同时被菌株HOxBLS定植。因此，两种菌株共同定殖是常见的。但是这两种菌株是否具有不同的临床特征意义还未确定。

二、人体研究

在人类中很大一部分人群都有oxf的定殖。在美国人口中。oxf的定值率预计在38-62%，但在世界范围，因为有限的抗生素接触所以oxf的定殖率更高。例如，据报道在印度的定殖率大概在60%。韩国的在77%(16,17)。低oxf定值率与以下几种疾病有关:炎症性肠病、复发性肾结石、病理性肥胖、囊性纤维化、先天性肾结石，所有这些都和草酸钙肾结石有关。

在一项关于乌克兰儿童oxf定殖研究中，研究者进行了一项横断面研究的调查。这些儿童在童年时期很少接触日常抗生素而被当做研究对象。6-9个月以下的儿童不能被检查出oxf，直到1周岁时肠内才开始出现。在3-4周岁时，所有儿童都有oxf定值，8-12时儿童体内的Oxf定值下降。另外一组特殊的病人即为患有囊性纤维症的患者，这种患者患肾结石的风险高于常人。CF患者由于易患肺部感染而接受多个疗程的抗生素治疗。在一项关于CF患者尿液草酸盐排泄的研究中，21例未患CF中71%都被Oxf定值，43例CF患者只有16%被Oxf定值（19）。所有被oxf定值的CF患者都有正常的草酸排泄，而未定值的36名患者有53%都有高草酸尿症，这支持了oxf存在有效对抗高草酸尿症这一假说。

三、肾结石与产甲酸草酸杆菌的联系

多项流行病学研究证明了oxf的保护作用。人类研究证明oxf定值与复发草酸钙肾结石有明显的反向联系。通过年龄、性别和地区匹配的247例草酸钙复兴结石患者与259例无结石患者的对照研究结果表明：oxf定值与复发性草酸钙结石是负相关，并可减少70%的风险（20）。在对照组中，oxf定值的增加可以看见草酸盐的消耗增加。抗生素使用的则相反。24小时尿液收集显示尿酸排泄增加的结石风险有明显上升趋势。然而，尿液中草酸排泄中值在oxf阳性和阴性的患者中没有差异。

一个关键的未回答的问题是：oxf的缺乏是否通过尿液中草酸的排泄从而增加草酸钙结石形成的风险。在控制和标准化饮食下，oxf阳性患者的尿液草酸排泄要低于oxf阴性患者。22名非结石患者（oxf天然定殖或不定殖）的饮食控制研究结果表明：尿液草酸排泄的差异可能受到饮食中钙和草酸摄入量的影响。

 Duncan等人研究表明：口服摄入单剂量的oxf，接着吃草酸盐食物，导致尿中草酸盐排泄减少，粪便中草酸盐降解活性恢复，3名参与者中有3名长期定殖。一项关于原发性高草酸尿症患者的随机、多中心的研究未能显示出oxf治疗尿草酸盐排泄的明显治疗效果。虽然结果显示尿液草酸对肌酐标准化治疗效果，但是给与细菌治疗的剂量和可行性遭受质疑。

四、口服抗生素对人类和老鼠oxf的影响

最近的研究调查了抗生素的使用可能是成人中oxf流行率下降的原因这一假设。在接受口服抗生素治疗幽门螺旋杆菌（HP）的患者中评估了抗生素对OXF定值的影响。oxf菌株对多种抗生素敏感，包括喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和甲硝唑。在一项前瞻性的研究中，比较了克拉霉素或甲硝唑治疗HP阳性组合未接受抗生素治疗HP阴性对照组的Oxf定殖率。12例患者中，未给与抗生素治疗，92%的患者在初始粪便检测中oxf阳性，在1个月和6个月进行粪便监察时oxf仍保持阳性。相比之下，对于Oxf呈阳性且对HP进行抗生素治疗的19名受试者中，只有38％的患者在后续的粪便检测中保留了Oxf阳性。只有1名参与者：oxf定殖在抗生素使用下消失，6个月后又恢复了oxf定殖。这些研究表明：抗生素使用后持续消除oxf可能是肾结石形成的危险因素。

另外一项研究检查了除小鼠饮食改变外，抗生素的影响，以了解由此产生的生理紊乱。在早期小鼠模型的抗生素治疗（PAT）中，将小鼠分成3组。对照组不接受抗生素治疗，其它两组接受3次泰乐菌素（大环内酯类）或阿莫西林。为了看到PAT模型对草酸降解的影响，随时间测量参与草酸盐代谢的三种基因中的每一种的平均相对丰度。Oxc、frc、oxIT不是oxf特有的，但可能来自其它草酸盐降解菌。图2显示了抗生素应有和饮食改变引起oxc、frc和oxIT基因表达相对丰度的显著变化。但是变化的方向并不统一。这可能表明：这些变量对包括oxf在内的草酸盐降解细菌有不同影响。

动物研究：多项实验研究了在动物模型中降低尿草酸排泄的作用。sidhu等研究表明：在大鼠体内定殖oxf可减少尿液草酸的排泄。同样，在原发性高草酸尿的小鼠模型中，遗传性疾病导致内源性草酸盐产生增加，oxf诱导草酸盐肠溶分泌，最终减少尿中草酸盐排泄。当使用细菌的裂解物代替整个细菌时，尿中草酸盐同样减少。chen等人用oxc和frc基因转染小鼠干细胞，oxc和frc基因编码草酸脱羧酶和甲酰基Co-A转移酶，并证明培养基中草酸盐水平降低。

另外一种假设是：oxf不仅可以用过减少肠道吸收，还可以通过增强肠道草酸盐的分泌从而减少尿草酸盐的排泄。hathch等人报道：oxf通过诱导远端结肠分泌与结肠上皮细胞相互作用，从浆膜到粘膜的草酸盐净分泌量，导致尿液排泄减少。这通过使用两种oxf（人和大鼠细胞株）对小鼠的研究表示。与未定殖的野生型小鼠相比，oxf定值的小书中氯化物/草酸盐交换蛋白slc26a6的结肠表达没有变化。

Oxf强化了Oxf刺激的草酸盐分泌的合理性，具有明显的促草酸盐分泌的作用。虽然尚未鉴定出作用分子，暴露于Oxf的培养基，对原发性1型高草酸尿的小鼠经直肠给予Oxf，减少尿草酸盐排泄（> 32.5％）并刺激Ussing室中的远端结肠草酸盐分泌（> 42％）。作用机制包括蛋白激酶A激活SLC26A6转运蛋白而不增加蛋白质的表达。这些影响还没有已在人结肠中重现，但描述于人肠Caco-2-BBE细胞中。由于在没有高外源性草酸盐的情况下维持持续的Oxf定殖仍然很困难，鉴定Oxf衍生的生物活性因子，诱导结肠草酸盐分泌，从而减少尿草酸盐排泄，可能具有重要的治疗潜力

最近成功用Oxf对无菌小鼠进行单一定殖表明Oxf不需要其他生物体来存活。实验表明，这些单一定殖与无菌小鼠相比，小鼠的尿草酸盐排泄显着减少。 这一发现可能在Oxf作为益生菌这一方面发挥重要作用。

五、 益生菌和整个微生物群落的潜在作用：

最近从哺乳食草动物Neotoma albigula到实验室大鼠的草酸盐降解细菌的微生物移植导致草酸盐降解细菌的显着增加和持续定植。该结果可能代表治疗干预的新目标，以赋予跨物种持久的草酸盐降解。  试图通过口服益生菌制剂将草酸盐降解微生物引入人或大鼠肠道中暂时导致尿草酸盐排泄减少。这些口服益生菌制剂包括单独的Oxf，或乳杆菌，双歧杆菌，肠球菌和其他草酸盐降解剂的不同组合。对于所有配方，在人类和啮齿动物中测试的益生菌最初导致草酸盐排泄减少; 然而，细菌和它们的草酸盐降解功能是在草酸盐从饮食中去除后5天通常检测不到[7,32]。

尽管缺乏肠道微生物组改变与肾结石发病率之间直接因果关系的研究，但所评论的文献具有高度的启发性。虽然这一领域的研究仍处于早期阶段，但测序技术和分析工具的进步为探索以往尚未解答的关于肠道和尿液细菌在结石形成机制中的作用的问题提供了独特的机会。（到目前为止，还没有研究将尿液中的非致病细菌（与肠腔相比）与肾结石相关联）。

在开展进一步研究时，可以确定并考虑先前研究中的一些限制。所有动物研究都通过添加Oxf和改变饮食来操纵啮齿动物的微生物体系。我们知道人类微生物组和饮食与啮齿动物有显著差异，因此有必要找到更具代表性的模型从而更好地了解人体。此外，理解肠道微生物组作为执行功能的细菌物种的网络，例如，草酸盐降解，而不是作为单一物种，可能具有重要的治疗意义。

Fig. 1.Metabolism of oxalate by Oxf [6]. Reproduced with permission.

Fig. 2.Changes in the relative abundance of gene expression of oxc, frc, and oxlT during development with pulsed antibiotic treatment [24] (HFD: high fat diet reproduced with permission 

Table 1 Reported Oxf colonization rates in various adult populations.