16分+新思路 乳腺癌+单细胞+异质性+药物

导语

本论文对乳腺癌细胞系进行了单细胞分析，以研究肿瘤的异质性和药物反应。作者发现生物标志物的表达存在高度的异质性，并提供了一个框架来确定肿瘤在细胞系组成和药物反应方面的异质性。

背景介绍 

今天小编为大家带来一篇发表在16分+ nc期刊的思路。题目为A single-cell analysis of breast cancer cell lines to study tumour heterogeneity and drug response。 本文对乳腺癌细胞系进行了单细胞分析，以研究肿瘤的异质性和药物反应。作者发现生物标志物的表达存在高度的异质性，并提供了一个框架来确定肿瘤在细胞系组成和药物反应方面的异质性。他们还将细胞系中大规模体外药物筛选的结果与单细胞数据联系起来，从单细胞特征开始计算预测药物反应。该论文对乳腺癌细胞系及其对药物的反应进行了全面分析，这有助于为乳腺癌患者制定个性化治疗策略。

数据介绍 

该论文使用来自32个乳腺癌细胞系的35,276个单个细胞的转录谱来生成单细胞图集。作者还分析了癌症基因组地图集（TCGA）中包括所有四种不列颠哥伦比亚省类型的937名乳腺癌患者中22种生物标志物的表达。他们还收集了大规模的体外药物筛选数据，报告了450种药物对来自实体瘤的658个癌细胞系的影响。

研究设计

结果解析 

01、乳腺癌细胞系的单细胞转录组分析    

研究对 31 种乳腺癌细胞系进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，其中 16 种来自转移部位 ，以及另外一种非癌细胞系 (MCF12A )通过Drop-seq技术 。研究选择这组细胞系是因为它们涵盖了所有主要的乳腺癌肿瘤亚型（LuminalA/LuminalB/Her2-enriched/Basal Like），并广泛用于癌症研究和药物开发，同时在基因组方面也得到了充分表征和（大量）转录水平，以及药物反应 。 预处理方法后，研究总共保留了35,276个细胞，每个细胞系平均有1069个细胞，每个细胞捕获3248个基因。
接下来，本文生成了包含 32 个细胞系的图谱，如图 1A 所示 。在图谱中，可以通过来自不同管腔细胞系和富含 Her2 的 (Her2+) 细胞系的细胞混合来识别管腔超群，而三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞系形成不同的簇，从而表明这些代表了不同疾病的实例。本文研究了基因组特征是否可以解释此类簇的形成。为此，根据基因组变异或拷贝数变异（CNV）对细胞系进行聚类 。根据基因组变异进行聚类 ，没有产生任何有意义的聚类。相反，根据 CNV 进行聚类产生了八个不同的聚类 ，以检查 CNV 是否可以解释单细胞簇的一些特征；本文没有发现明显的模式：例如，基于 CNV 的簇 5（青色）包含具有相似 CNV 的三个细胞系（AU565、BT474 和 T47D）；然而，Her2 + AU565 细胞系在单细胞图谱中形成独特的簇，而 luminal BT474 和 T47D 细胞系属于 luminal-supergroup；类似地，基于 CNV 的簇 4（蓝色）包含三个细胞系（CAL51、BT549 和 HS578T），但它们在单细胞图谱中形成不同的簇。

图1 乳腺癌单细胞图谱

临床相关生物标志物的单细胞表达（图 1B、C ），包括雌激素受体 1 (ESR1)、孕激素受体 (PGR)、Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2（ERBB2 又名 HER2）和上皮生长因子受体 (EGFR)不同细胞系的结果与其报告的状态一致 。 为了进一步了解每种癌细胞系，我们分析了 48 种基于文献的临床相关生物标志物的表达 ，如图 1D 所示。管腔细胞系高度表达管腔上皮基因，但不表达基底上皮或基质标记；相反，三阴性 BC 细胞系表现出类似基底细胞的表型 ，并且具有三阴性阴性 B 亚型细胞系也表达波形蛋白 (VIM) 和 VI 型胶原蛋白 Alpha 链 (COL6A1、COL6A2、COL6A3)  。有趣的是，五分之二的 HER2+细胞系（JIMT1 和 HCC1954）与图谱中的三阴性细胞系接近，并表达角蛋白 5 (KRT5)（图  1A、D ），这与不良预后和曲妥珠单抗耐药性有关 。事实上，两种细胞系都对抗 HER2 治疗有抵抗力 。最后，非致瘤性 MCF12A 细胞系缺乏 ESR1、PGR 和 HER2 的表达，并表现出基底样表型，其特征是所有基底样标记基因（包括角蛋白 5、14、17 和 TP63）的表达，与文献一致  . 总的来说，这些结果表明单细胞转录组学可以成功地用于捕获临床相关标记物的整体表达。 

02、BC 单细胞图谱识别临床相关转录特征     

通过对图谱中的 35,276 个单细胞进行聚类，我们识别出 22 个簇，如图  1E 所示。在管腔超群中，细胞并不根据其来源细胞系进行聚类，实际上，五个管腔簇中的四个包含来自不同细胞系的细胞（图1F ）。相反，三阴性细胞系倾向于根据其来源细胞系进行聚类，每个聚类主要包含来自同一细胞系的细胞（图 1F ）。本文确定了同一簇中的细胞与图谱中所有剩余细胞之间差异表达的基因。然后，我们为每个簇（即差异最大的表达）选择一个基因，以获得总共 22 个簇衍生的生物标志物（图  1G、H ）。ESR1和ERRB2都不属于该组。文献挖掘证实了其中一些基因的重要性：来自管腔超群簇的生物标志物（图  1G ）与癌症进展（BCAS3 簇 2）、扩散（SCGB2A2  簇 6）、增殖（DRAIC 簇 1)  、迁移和入侵(CLCA2  簇8 和 PIP  簇 18)。有趣的是，虽然 DRAIC 与管腔 BC 患者较差的生存率相关 38 ，但 CLCA2 和 PIP 均与良好的预后显着相关。为了检查这 22 种生物标志物的临床相关性，我们分析了癌症基因组图谱 (TCGA) 收集的 937 名乳腺癌患者的表达，涵盖所有四种 BC 类型。如图1H 所示，并 进行量化，Luminal A、Luminal B、Her2+ 和三阴性患者中 22 个簇衍生的生物标志物的表达存在显着差异。此外，可以区分每个类别内的亚型，这可能会产生额外的诊断/预后生物标志物（图  1H ）。例如，其中两种生物标志物（MAGE4和XAGE4）仅在三阴性乳腺癌患者和HER2 + /ER−患者的子集中高表达（图1H   ） ）；有趣的是，通过蛋白质组学分析，两者之一（MAGE4）先前已在文献中报道为在此类患者中过度表达 。第二组三阴性患者的特征是肌动蛋白 γ2 表达 (ACTG2)，之前已将其在 BC 中与细胞增殖 和铂类化疗敏感性 联系起来。我们观察到图谱中的两个三阴性细胞系（HS578T 和 MX1）显示出比图谱中所有其他细胞更高的 ACTG2 表达 。 为了证实与顺铂敏感性的联系，我们用顺铂处理两种细胞系，并在不同剂量下测量 72 小时的细胞活力 。这 些结果证实了两种细胞系的顺铂敏感性，尽管 HS578T 细胞中的顺铂敏感性高于 MX1 细胞。 最后，为了进一步确认这 22 个簇衍生的生物标志物基因的临床相关性，我们将它们从 TGCA 患者的大量 RNA-seq 数据中正确分类 BC 亚型的性能与临床批准的 PAM50 基因特征（50 个基因） 进行了 比较 。如图  1I 所示，所有四种亚型的分类性能均优于随机分类性能，但仅对于基础亚型而言与PAM50相当，而HER2过表达癌症的性能最差。正如预期的那样，当将ERBB2添加到 22 个基于簇的生物标志物列表中时，该亚型的分类得到了改善（图 1I） ）。值得注意的是，与 PAM50 不同，这 22 种生物标志物是从单细胞图谱自动得出的，无需使用任何乳腺癌亚型的先验知识。总之，这些分析证实单细胞 BC 细胞系图谱可用于自动识别临床相关基因，这可用于患者分层和肿瘤类型分类。 

03、BC 图集作为自动化癌症诊断的参考

BC 图谱可用作比较患者组织活检的单细胞转录组学数据以及进行癌症亚型分类和肿瘤异质性评估的参考。为此，我们开发了一种算法，能够将患者的单细胞转录谱映射到 BC 图谱上，并为每个患者的细胞分配特定的细胞系。我们测试了该算法根据单细胞转录谱正确映射图谱中每个细胞的能力，方法是首先将图谱中的单细胞转录谱划分为训练集（每个细胞系中的 75% 的细胞），和测试集（每个细胞系中 25% 的细胞）。对于大多数细胞系（32 个中的 28 个），测试集上的映射算法的准确度大于正确映射细胞的 75%。然后，我们将公开的 50 个 单细胞转录谱映射到 BC 图谱上，这些转录谱是从参加新辅助化疗治疗临床试验的 5 名三阴性乳腺癌患者获得的，并对苏木精和伊红染色的组织切片进行病理学评估，对这些患者进行免疫组织化学分析。雌激素受体（<1%）和孕激素受体（<1%）以及HER2扩增的荧光原位杂交分析（HER2与CEP-17的比率<2.2）。如图  2A 、 B所示 ，大多数患者的细胞按预期映射到三阴性簇，但 TNBC5 患者的样本除外，该样本的大多数细胞映射到管腔超组。有趣的是，TNBC5 是唯一一位同时高表达雄激素受体 AR 和转录因子 FOXA1 的患者 。文献报道，这两个基因的共表达发生在约 15% 的三阴性乳腺癌患者中，并且它被认为是一类独特的基底样肿瘤，可诱导管腔样基因特征 。这一观察结果表明，患者 TNBC5 细胞被映射到管腔细胞系，因为算法发现这些细胞系在图谱中最相似。为了进一步研究 TNBC5 异常表达谱，我们将 PAM50 特征应用于 5 名 TNBC 患者的伪批量表达谱。伪批量是指使用单细胞表达谱来计算平均基因表达，从而模拟批量基因表达测量。 虽然患者 TNBC1、2、3 和 4 被正确分类为 basal 样的概率约为 99%，相反，TNBC5 只有 4% 的概率为 basal 样，而 HER2 的概率为 47% -丰富，并且有 48% 的管腔概率，与我们的映射算法预测一致，并进一步证实了该患者的特殊性。这些结果表明，异质性因患者而异，但存在于所有样本中，因为没有患者的活检映射到单个细胞系。此外，有关组成肿瘤的单个细胞系的药物敏感性的信息可能有助于指导治疗选择。

图2 患者肿瘤细胞的自动分类

接下来，我们在从两名患者的组织活检中获得的公开的 53 个 空间转录组数据集上测试了该算法，其中一名患者诊断为 ESR1 + /ERBB2 +小叶雌激素阳性癌（图  2C ），另一名患者诊断为 ESR1 + / ERBB2 +导管癌 。公开可用的数据集包括患者 1 的 3808 个转录谱（图  2C ）和患者2的3615个转录谱 ，每个都从尺寸为 50 × 50 × 50 um 的不同组织“瓦片”中获得。用于诊断的 IHC 和 HER2 FISH 数据尚未公开。该算法将每个空间图块投影到 BC 图集上，并为每个图块分配一个单元系。我们根据映射的细胞系或映射的细胞系的 BC 亚型对图块进行着色（图  2C ） ）以生成瓷砖的自动癌症亚型分类。两名患者的大部分图块仅分配给两个细胞系，并正确分类为管腔（A 或 B）；患者 1 的剩余 13% 和患者 2 的 20% 的图块被分类为 HER2 过表达或三阴性，这可能是指导治疗选择和预测耐药性发生的重要信息。由于空间数据不具有单单元分辨率，因此每个空间图块本身也可以是异构配置文件的混合。因此，另一种方法是使用生物信息学工具，例如 Cell2Location ，它可以在 BC 单细胞图谱上进行训练，并用于估计每个空间图块的细胞系组成，而不是尝试将整个图块分配给仅一个细胞系。由于大量基因表达谱比单细胞基因表达谱更具临床相关性，我们接下来在我们的单细胞图谱上训练了最近发布的名为Bisque （方法）的生物信息学工具来预测肿瘤样本的细胞系组成。Bisque 最初设计用于根据复杂组织的大量 RNA-seq 数据估计细胞类型比例。 为了测试 Bisque 在我们环境中的有效性，我们首先将其应用于 CCLE 中公开提供的乳腺癌细胞系的批量 RNA-seq 转录组数据数据库中也存在于我们的图谱中（即32个细胞系中的29个）。然后，我们使用 Bisque 从每个细胞系的大量基因表达谱中预测其组成，并使用图谱中的单细胞转录谱。 对于 29 个大量基因表达谱中的每一个，Bisque 正确预测组成它的最大部分细胞来自图谱中相应的细胞系，范围在 40% 到 80% 之间。
然后，我们将 Bisque 应用到 TGCA 的 937 名乳腺癌患者的大量基因表达谱中，这些患者的 BC 亚型已注释，然后为每位患者分配相应的细胞系组成，如图 2D、E  所示 。令人放心的是，被诊断患有特定乳腺癌亚型的患者往往具有由相同亚型的细胞系组成的肿瘤细胞系组合物。我们在图  2F 中量化了这一观察结果，并观察到一些有趣的例外：JIMT-1 是一种 HER2 过表达细胞系，具有扩增的 ERBB2 位点，但对于没有 HER2 + 患者，Bisque 预测 JIMT-1 细胞系是构成 HER2 + 患者的细胞系。患者细胞系组成的最大部分。有趣的是，JIMT-1 细胞对抗 HER2 治疗具有抵抗力 ;另一个例子是HS578T细胞系，据报道该细胞系是三阴性的；然而，大多数映射到它的患者都是管腔的；有趣的是，据报道该细胞系对抗 ESR1 药物 氟维司群 敏感我们最终量化了在单细胞图谱上训练的 Bisque 算法在从批量 RNA 测序中正确分类 937 名 TGCA 患者的肿瘤亚型方面的性能。为此，我们为每位患者分配了构成患者细胞系组成最大部分的细胞系肿瘤亚型。图 2G 报告了准确率-召回率曲线方面的分类性能，曲线下面积达到 0.71。总而言之，这些结果表明 BC 单细胞图谱可用于根据单细胞表达谱和大量基因表达谱自动分配细胞系组成和癌症亚型。 

04、临床相关生物标志物在BC细胞系中表现出异质和动态表达     

临床相关受体在属于同一细胞系的细胞之间异质表达，如图3A中通过计算表达受体的细胞系中的细胞百分比来评估。考虑 BC 图谱中存在的7个 Luminal B 和HER2 +细胞系，根据定义，它们过表达HER2：而AU565、BT574和 HCC1954细胞系中超过90%的细胞表达ERBB2，在其余4个细胞系中ERBB2表达范围为EVSAT细胞的31%到JIMT1细胞的46%以及MDA-MB-361细胞的 64%。尽管JIMT1和MDA-MB-361都含有包含ERBB2基因的基因座的拷贝数增益，但这种情况还是发生了。本文首先排除了这些结果是单细胞RNA测序技术的伪影的可能性，通过显示估计的 BC 受体异质性与测序深度不相关，并通过假设测序数据的泊松采样的 模拟 方法。更具体地说，我们针对每个细胞系计算了图3A中四种临床生物标志物中每一种的细胞间零计数的预期比例。然后我们测试了泊松模型下实际的零比例是否高于预期，因为零通胀表明细胞异质性的存在6。因此，我们发现，除了两种（ZR751 和 BT549）外，所有细胞系中四种生物标志物中至少一种的临床生物标志物表达的异质性是显着的（p值 < 0.05）。此外，对于MDA-MB-361细胞系，ESR1、PGR和ERBB2均被发现具有显着异质性表达。我们还通过流式细胞术评估了三种代表性细胞系中的HER2蛋白水平：AU565（高 HER2 表达）、MDA-MB-361（异质HER2表达）和HCC38细胞系（低HER2表达）。如 图3B所示，单 细胞转录数据与细胞计数分析一致；然而，这种异质性的起源尚不清楚。为了排除可遗传的遗传差异作为异质性来源，我们将MDA-MB-361细胞分为HER2+和HER2-亚群，并检查这些同质亚群是否随着时间的推移保持稳定，或者自发地产生异质群体。如 图3C 所示，培养18天后，两个亚群都重新建立了最初的异质性，证明这些细胞中的HER2表达是动态的并且由尚未发现的机制驱动。

图3 乳腺癌细胞系的转录异质性及其对药物反应的影响

有趣的是，从 ER + /HER2 -乳腺癌患者中分离出的HER2 +循环肿瘤细胞 (CTC) 先前被证明可以自发地从 HER2 -和 HER2 +相互转化，其中细胞具有产生相反细胞的子代的表型 60 。为了检查细胞周期阶段是否可以解释 MDA-MB-361 细胞系中观察到的异质性，我们根据单细胞转录组数据计算预测HER2-和 HER2+亚群中每个细胞的细胞周期阶段。 如图 3D 所示，HER2-的比例较高与 HER2+细胞相比，预测细胞处于S期和G2/M期，同时处于G1期的比例较低。这一结果与之前的观察结果一致，即 HER2 抑制后细胞周期停滞在 G2/M 期 。 接下来，我们通过计算HER2+细胞与HER2-细胞的单细胞转录谱的差异表达基因(DEG)来识别两个亚群之间不同的生物过程 。基因集富集分析 (GSEA)  对照 DEG 排名列表，如图3E 所示，仅揭示了7个显着富集的途径 (FDR < 10%)：其中4个在HER2+细胞中上调，但在HER2-细胞中下调，并包括脂肪生成、肌肉生成和OXPHOS，所有这些都表明上皮间质转化(EMT)参与，这在之前已在 HER2 +中观察到细胞的 三个通路在HER2-细胞中上调，并与细胞周期相关，特别是与G2/M期相关，与本文之前的分析一致，表明细胞周期可能在该细胞系中的HER2表达中发挥作用。这些结果表明，临床相关生物标志物表达的异质性甚至在癌细胞系中也存在，并且它也可以是动态的和非遗传性质的。 

05、基因表达的异质性影响药物反应  

为了研究基因表达异质性对药物反应的作用，本文收集了大规模体外药物筛选数据报告了450种药物对来自实体瘤的658个癌细胞系的作用。如图3F所示，BC细胞系对HER2抑制剂的敏感性与细胞系中表达ERBB2的细胞百分比显着相关。即使使用细胞系的大量基因表达（可从癌细胞系百科全书-CCLE的 CTRPv2 数据集中获得）代替细胞百分比）。

有趣的是，在单细胞水平上，除了含有ERBB2基因座CNV的细胞系外，表达受体的细胞之间的受体表达基本上相同，无论它们属于哪种细胞系。此外，通过分析 CCLE 数据库中已知同源靶点的所有药物，我们发现药物靶点表达与药物敏感性之间的相关性也适用于 CTRPv2 和 GDSC数据集中302种靶向药物中的66种药物（图3G）。这些结果表明，由细胞异质性引起的同一肿瘤细胞内基因表达的变异性可能导致某些细胞对药物治疗反应不佳。

从这些观察出发，我们开发了DREEP（单细胞表达谱的药物估计），这是一种生物信息学工具，从单细胞转录谱开始，可以在单细胞水平预测药物反应。为此，本文首先检测了450种药物的基于表达的药物敏感性生物标志物 ，如图  3H、I 所示。简而言之，我们交叉了来自CCLE 的CTRPv2数据集的数据 利用来自批量RNA-seq的细胞系基因表达谱，研究了来自实体瘤的658个癌细胞系对 450种药物的反应。在CCLE中，药物效力被评估为剂量反应图的曲线下面积（AUC）的倒数，AUC值低表明药物敏感性，而高值意味着耐药性（图3H ）。

对于每个基因和每种药物，我们计算了658个细胞系中基因表达与相同细胞系中药物效力之间的相关性。因此，与AUC正相关的基因是潜在的耐药标记，反之亦然，负相关的基因是敏感性标记 （图3H） ）。通过这种方式，我们为450种药物中的每一种生成了基于表达的药物敏感性和耐药性生物标志物的排名列表。然后，我们使用这些生物标志物来预测图谱中32个细胞系的单细胞水平的药物敏感性，如图 3I 所示。为此，对于图谱中的每个细胞，本文通过基因集富集分析 (GSEA)将细胞表达最多的250个基因与450种药物中每一种药物的生物标志物排名列表进行比较，从而得出450个 富集 分数(ES)与相应的p-value。最后，细胞被认为对与阴性ES相关的药物敏感。如果没有发现显着且阴性的ES评分，则该细胞被注释为未分类。为了将预测从单细胞水平转换为细胞系水平，我们选择了预计在细胞系中最大部分细胞中起作用的药物。我们从单细胞转录组数据开始，测试了DREEP在预测图谱中32个细胞系的药物敏感性方面的性能。我们选择了两个独立的“黄金标准”，一个来自CTRPv2数据集中658个癌细胞系的450种药物的实验药物效力数据，另一个来自癌症药物敏感性基因组学 (GDSC) 研究 ，其中包括约250个小分子（其中只有86个与CTRPv2数据集相同）的50%抑制浓度 (IC50)测量的药物效力数据。

图谱中 32 个细胞系的整体性能在图3J 中报告了 CTRPv2 黄金标准。为了通过实验验证DREEP，我们转向MDA-MB-361细胞系，我们发现该细胞系共存有两个不同且动态的细胞亚群（HER2+和HER2-）。我们将 DREEP 应用于每个亚群，以确定能够选择性抑制HER2−亚群或HER2+亚群生长的药物：预计42种药物（FDR < 1% ）会优先抑制HER2 −的生长。这些药物中最常见的一类是DNA拓扑异构酶抑制剂 (TOP1/TOP2A) 如依托泊苷。令人惊讶的是，没有发现药物可以特异性抑制 HER +细胞的生长，而44种药物(FDR < 1%) 预计对两个亚群同样有效，并且意外地包括 HER2 抑制剂，例如阿法替尼 。 我们选择依托泊苷和阿法替尼进行进一步的实验验证。MDA-MB-361细胞首先通过FACS分选为HER2+和HER2-亚群，然后在五种不同浓度的药物处理 72 小时后测量细胞活力，如图3K 所示。与DREEP 预测一致，HER2-细胞对依托泊苷比HER2+细胞更敏感，而阿法替尼对两个亚群同样有效。 这一违反直觉的结果与 Jordan等人 使用来自BC患者的循环肿瘤细胞（分类为HER2）观察到的结果类似HER2-和HER2+亚群，发现它们对拉帕替尼（另一种 HER2 抑制剂）同样敏感，但没有提出作用机制。我们假设 MDA-MB-361 细胞在 HER2 -和 HER2 +状态之间的动态相互转换可以解释这一令人惊讶的结果：当起始群体仅由 HER2 -细胞组成时，其中一些细胞仍然会相互转换为 HER2 +细胞在阿法替尼治疗期间，它们会因此对 HER2 抑制变得敏感，这解释了观察到的结果。我们用一个简单的数学模型（补充图  21  -  23 和补充注释 0  1 ）在数学上形式化了这个假设，其中两个物种（HER2 +和 HER2 −细胞）可以复制和相互转换，但只有一种（HER2 +）受到阿法替尼治疗的影响。

该模型表明，如果两种细胞状态之间的相互转换时间与细胞周期相当，那么阿法替尼治疗将对两个亚群产生相同的效果。相反，如果相互转换时间远长于细胞周期，则阿法替尼对 HER2 −分选细胞影响很小，但对 HER2 +分选细胞影响最大，反之亦然，如果相互转换时间远短于细胞周期，那么阿法替尼对 HER2 -和 HER2 +分选细胞的影响都很小。 因此，将建模结果与实验结果进行比较表明，相互转化率应与细胞周期处于同一数量级（MDAM361 细胞约为 72 小时）。

该模型进一步预测，用阿法替尼治疗未分选的 MDA-MB-361 细胞群会降低 HER2 +细胞的百分比，因为只有 HER2 +会受到影响，但一旦阿法替尼治疗中断，该百分比就会迅速恢复 。 为了测试模型预测，我们用阿法替尼和依托泊苷处理 MDAM361 细胞系（未分选），然后通过细胞荧光测定法评估处理前后 HER2+ 和 HER2- 细胞的百分比。如图  3L、M ，依托泊苷增加了HER2 +细胞的百分比，这与HER2 -细胞对该治疗的敏感性增加一致，而阿法替尼强烈降低了HER2 +的百分比细胞，证实其效果仅针对 HER2 +细胞。接下来我们测量了 HER2 +的百分比从培养基中去除阿法替尼后的细胞；如图 3N、O所示， HER2+细胞的百分比迅速增加，证实了建模结果。接下来我们研究了阿法替尼和依托泊苷组合在 MDA-MB-361 细胞中的作用。具体来说，我们在三次重复实验中测试了 20 种不同的组合，并测量了对治疗的反应的细胞活力 。然后，我们使用该数据集来估计这两种药物是否具有相加、协同或拮抗作用。

总体而言，使用Excess over Bliss模型测量的所有组合的平均协同得分 ，与加性效应兼容（协同得分为-12.0，置信区间为±4.07，因此落在-10到+10的区间内，被视为加性 ）；然而，对于低浓度的阿法替尼和高浓度的依托泊苷，我们确实观察到药物具有拮抗作用的意外趋势。这种抑制作用的部分原因可能是，HER2+癌细胞中的抗HER2治疗已被证明可以下调TOP2A以及参与G2-M细胞周期阶段的其他基因的表达 。这可能会导致依托泊苷治疗脱敏，因为它主要作用于TOP2A在细胞周期的S期和G2期。总而言之，我们的结果表明，DREEP可以从单细胞转录谱预测药物敏感性，并且基因表达的动态异质性确实在细胞群对药物治疗的反应中发挥着重要作用。 

小编总结

该论文对乳腺癌细胞系进行了单细胞分析，以研究肿瘤的异质性和药物反应。作者对31个乳腺癌细胞系进行了单细胞RNA测序，涵盖了所有主要的乳腺癌肿瘤亚型和一个非癌细胞系。他们总共保留了35,276个细胞，平均每个细胞系有1069个细胞，每个细胞捕获了3248个基因。作者发现生物标志物的表达存在高度的异质性，并使用反卷积算法根据肿瘤活检的批量基因表达谱确定细胞系组成，从而实现基于细胞系的患者分层。最后，他们将细胞系中大规模体外药物筛选的结果与单细胞数据联系起来，从单细胞特征开始计算预测药物反应。作者发现，转录异质性使药物敏感性差异的细胞能够在同一个群体中共存。总体而言，该论文提供了一个框架，可以根据细胞系组成和药物反应来确定肿瘤的异质性。

该论文得出的结论是，乳腺癌细胞系的单细胞分析可以为确定肿瘤在细胞系组成和药物反应方面的异质性提供框架。作者发现生物标志物的表达存在高度的异质性，并使用反卷积算法根据肿瘤活检的批量基因表达谱确定细胞系组成，从而实现基于细胞系的患者分层。他们还将细胞系中大规模体外药物筛选的结果与单细胞数据联系起来，从单细胞特征开始计算预测药物反应。作者发现，转录异质性使药物敏感性差异的细胞能够在同一个群体中共存。总体而言，该论文深入探讨了肿瘤异质性对药物反应的影响，并强调了单细胞分析在个性化癌症治疗中的潜力。