iPSC临床应用的路在何方？

近年来，多能干细胞iPSC疗法乘着整个细胞疗法领域发展的东风逐渐崭露头角，其超强的分化能力赋予了广泛的用途，可治疗多种疾病，如糖尿病、神经性疾病和癌症等，还能创造和测试新的药物和疗法，并有可能攻克尚未能治愈的恶疾。iPSC重编程和定向分化技术如车之双轮能够实现低成本、批量生产，有望在商业化发展道路中高歌猛进。作为一个极具商业价值的市场领域，不少企业闻讯而来加紧布局，在iPSC领域分一杯羹，推进着iPSC细胞工艺技术的不断完善。

01、iPSC的无限扩增势孕育了无限潜能

iPSC的出现可追溯到2006年，日本科学家山中伸弥团队利用逆转录病毒将4个转录因子转入成体细胞，进而实现了“生命时钟”的逆转，将其转变为具有多能分化能力的诱导多能干细胞iPSC，自此开启了属于干细胞治疗的崭新分支。

多能干细胞（PSC）是一种可在体外无限扩增，并能分化为有三个胚层的细胞，这两个特性让PSC成为了细胞疗法最适合的细胞来源。多能干细胞的代表有胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）。iPSC技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞，医药研发人员从iPSC的自身优势中发掘了应用的无限潜能。

以下是iPSC主要优点的罗列： 

（1）iPSC直接来自成人的成熟分化细胞（常见皮肤细胞等），相对于胚胎干细胞（ESC）更具可预见性，不必担心其分化后成体健康状态问题。

（2）iPSC制备仅需少量供体细胞，保证其遗传多样性。

（3）iPSC可以在体外无限培养，分化为淋巴细胞并且生成主细胞系，为T细胞、NK细胞等细胞疗法提供了可再生的、稳定的细胞来源，可降低成本并保证细胞一致性。

（4）iPSC无需从胚胎提取，来源更便捷，具有类似于早期胚胎干细胞的发育能力，但同时避开了胚胎干细胞的伦理问题，更有可能获得美国联邦资助和支持，增加在世界保守地区使用的可及性。

（5）iPSC由自体提供，免疫排斥小。允许创建针对特定患者进行基因定制的细胞系，不存在同种异体免疫配型问题，有望消除免疫排斥的风险。

（6）iPSC在体外易于接受基因工程改造，有潜力接受多轮的基因工程优化步骤，如添加生长因子、设计生长基质等，可以实现控制细胞分化过程，增强细胞疗法的持久性。

这些优势及潜力扩展了iPSC的运用范围，可以分化成多种不同的细胞类型，从而产生多种类型的通用型免疫细胞疗法，包括iPSC-CAR-T、iPSC-CAR-NK等等。这些经基因工程改造并诱导分化的免疫细胞不会引起免疫排斥反应，同时可以表达各种不同的治疗性蛋白，并且在需要时扩增分化成为“即用型”T细胞或NK细胞疗法。另外，此疗法极大缩短了制备时间，有助于增强iPSC大规模生产的潜力和商业化前景。

02、见招拆招、破解iPSC研发挑战

虽然iPSC的发现已有24年之久且具有独特的应用优势，但iPSC的   产业应用实则尚属早期阶段。iPSC通过人体来源的终端体细胞重编程而来，基于PSC的细胞治疗目前面临的最主要的三大挑战，分别为致瘤性、免疫原性和异质性。  

致瘤性

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iPSC的增殖潜力与其致瘤性是iPSC的一体两面。iPSC无限增殖的潜力使其能够为患者移植准备数十亿种不同类型的人体细胞，但是如果细胞在移植后继续进行过度增殖，就有可能导致肿瘤形成。

其次，使用逆转录病毒生产iPSC与癌症相关，因为逆转录病毒可以在细胞基因组内的任何位置插入DNA，从而允许潜在激活致癌基因。重编程因子c-Myc是人类癌症中最常见的突变基因之一，通常起驱动作用。通过逆转录病毒转染四个重编程因子而诱导产生iPSC形成的嵌合小鼠常常会形成肿瘤。

目前主要有三种致瘤情况：

(1)未分化和/或未成熟的细胞保留在从人类PSC 分化的最终细胞产物中，则可能由于错误复制而出现畸胎瘤或肿瘤。该种原因造成的影响将是最严重的；

(2)重编程因子在iPSC中保持活性可能诱使肿瘤发生；

(3)iPSC培养过程中发生的基因突变引发肿瘤。

重编程工艺

针对重编程工艺有激活致癌基因的潜在风险，目前采用了RARg、LRH1、ASF1等重编程因子以产生一致、可靠、可定义的多能状态，将非致癌基因L-Myc和调控基因Lin28取代致癌基因c-Myc，并且正尝试利用非病毒技术来完成重编程过程，减少致癌率。

赛默飞的CTS™ CytoTune™-iPS 2.1仙台病毒重编程试剂盒是其第一款专为临床转化研究设计的重编程产品。它也是首个GMP条件下生产的商品化重编程系统；为成纤维细胞及血细胞提供无外源成分的重编程方案，以便进入下游的转化研究，能维持高效的重编程效果，经历更严格的质量控制，并提供充分的法规相关文件支持，以实现从科研到转化的无缝衔接。

▲ 图片来源： 赛默飞

此外，降低致瘤风险的方法有建立有效的体外定向分化方法；形成更严格的纯化程序去除未分化的细胞；仔细严格筛选iPSC细胞系移植；通过抑制细胞自我更新的关键信号通路抑制未成熟神经祖细胞的致瘤性。Masayo Takahashi团队首例临床试验中，iPSC衍生产品纯度保持95％以上，且几乎没有细胞表达未分化细胞的标志物，最终患者得以重见光明。

免疫排斥反应

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免疫排斥反应是细胞治疗中都不可避免的关键问题。自体iPSC的免疫原性较低，但基因异常表达仍有可能导致免疫排斥。同种异体“现货型”iPSC在降低成本、增加可及性的同时，免疫原性问题也更为突出。

克服异种移植引起的免疫排斥反应中，最为传统方法是免疫抑制剂；其次是HLA单倍型匹配，但这种方法仍然需要免疫抑制剂。研究者们利用基因编辑技术、“超级供体”干细胞库来解决免疫排斥问题。

“HLA隐藏”

随着近年来基因编辑技术的发展，“HLA隐藏”作为一种避免免疫排斥的新兴方法诞生，旨在通过删除B2M基因而使PSC中的HLA基因群的I类MHC失活。不过这有可能导致iPSC缺乏I类MHC而被自然杀伤(NK)细胞裂解，因此研究人员尝试引入HLA-E和B2M组成的嵌合分子来避免激活NK细胞。HLA“隐身”的最大优势在于利用少量的细胞系即可覆盖整个世界人群，可能成为通过型细胞来源。目前，这种方法仍在继续完善中。

▲ HLA隐藏示意图  图片来源：参考资料3 

建立“超级供体”干细胞库

人群中有些特殊个体的HLA基因5位点为高频单倍体的纯合子，来源于这些供体的细胞在细胞移植时能覆盖高数量的受体人群，这一类人也成为“超级供体”。针对免疫原性问题，建立一个“超级供体”干细胞库已成为发展的必要支持。

目前，我国也已建立了可覆盖约14%全国人口的超级干细胞库；并且不少企业也已经建成了独有的干细胞库用于研发和筛选。中盛溯源已陆续成功制备存储30个超级供体的多能干细胞株，可覆盖约20%全国人口，即3亿中国人群，并建立了临床级hiPSC制备的标准化方案和和质控标准。未来，中盛溯源仍将持续寻找中国人群超级供体，建立覆盖大多数中国人群的iPSC细胞库，并使用这些种子细胞开发大众用的起的普适性细胞药物。

▲ 图片来源：中盛溯源

异质性

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尽管iPSC都具有多能性和无限增殖的潜力，但不同细胞系的形态、生长曲线、基因表达和分化成各种细胞谱系的倾向均不相同，加之培养过程中有可能存在的刺激因素，PSC异质性给应用带来了障碍，而遗传背景是决定基因表达异质性的最大因素。

hPSC状态转变

为了克服异质性，研究人员试图将hPSC的“启动”状态转换为“初始”状态。已有多种诱导hPSC转变为初始状态的方法被公布，如使用生长因子的化学抑制剂组合，过表达NANOG和KLF2转录因子等。不过，这项技术目前尚未成熟，其转化得到的初始人类干细胞（naive hPSC）可能导致过速增殖，少数情况还可以发生染色体异常。此外大多数印迹基因在重新启动的细胞中会被抹去，这种异常印迹可能阻碍其临床应用。

03、商业化发展之路道阻且跻

阻碍iPSC市场化道路的，除了上述iPSC固有特性所引发的潜在安全问题外，复杂的生产制备工艺、尚未成熟的监管体制也造成了一定的阻碍。

▲ 图片来源：赛默飞

生产工艺和自动化

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iPSC的生产工艺较复杂，从获取材料、重编程到扩增、分化再到检测、储存，每一环节都有不确定性。iPSC大部分原材料为活细胞，工艺涉及大量的手动干预，生产细胞的质量因操作手法差异存在波动，从而给CMC带来极大挑战，是目前大规模生产面临的主要阻碍之一。

因此，iPSC可重复、稳定性高的生产过程是商业化发展所必经之路。企业应提早布局自动化生产，以此提升工艺的稳健性。

监管法规与iPSC技术同步完善

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iPSC产品的复杂性以及该领域技术的快速革新，对法规和监管层提出了严格的要求，势必要以更快的速度调整以适应行业的发展。目前中国已出台多项干细胞领域的相关政策，如《干细胞临床试验研究基地管理办法(试行)》等，将有力地提高了行业门槛和监管力度，规范化进行监管产品质控，扶持拥有核心技术的企业快速发展。而企业与监管部门的良性互动无疑是一阵东风，推动iPSC这艘潜力无限的小船在蓝海中航行，探索未知的医学领域。

04、结语

作为细胞治疗领域的萌新，iPSC从理论到实践仍有很多成长的空间，随着异质性、致瘤性、免疫原难题的逐个攻破，iPSC或将弥补免疫细胞疗法的短板，融合出价格更低、可及性更高的细胞治疗药物，可能颠覆神经退行性疾病的治疗。利用iPSC的发展趋势，及填补市场空缺产品的开发策略，或许能令研发公司快速地占据市场、站稳脚跟。iPSC无限分化的潜能与人类的无尽科学探索将碰撞出怎样的火花，让我们拭目以待。
参考资料：
1.https://www.nuwacell.com
2.https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/40th-anniversary.html
3.https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.09.014
来源： 医麦客 2023-06-27

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