科研丨中科院动物所: 肠道菌群与高密度拥挤胁迫下小型哺乳动物的衰老相关过程有关(国人佳作)

编译：微科盟狗尾巴草

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

人类和动物经常遭受高密度拥挤胁迫，这可能会加速其衰老过程。然而，肠道菌群在高密度拥挤胁迫下调控衰老相关过程的作用尚不清楚。本研究发现，高密度饲养环境显著增加了应激激素(皮质酮)水平，加速了衰老相关过程，如端粒长度(脑和肝细胞)和DNA损伤或炎症(如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-10水平)，并缩短了布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)的寿命。来自不同饲养密度的供体田鼠的粪便微生物群移植在受体田鼠的衰老相关过程中引起了类似的变化。消除高密度环境或丁酸给药可延缓高密度饲养田鼠的脑和肝细胞中衰老相关标志物的出现。本研究表明，肠道微生物可能在调节动物密度依赖性衰老相关过程和随后的种群动态中发挥重要作用，并可作为缓解高密度拥挤胁迫下人类压力相关衰老的潜在靶点。

论文ID

原名：Gut Microbiota is Associated with Aging-Related Processes of a Small Mammal Species under High-Density Crowding Stress

译名：肠道菌群与高密度拥挤胁迫下小型哺乳动物的衰老相关过程有关

期刊：Advanced Science

IF：15.1

发表时间：2023.3

通讯作者：张知彬

通讯作者单位：中国科学院动物研究所

DOI号：10.1002/advs.202205346

实验设计

结果

1饲养密度对田鼠寿命的影响

在实验1中，饲养密度对雄性和雌性田鼠的寿命(以存活率反映)均有显著影响(雄性：p＜0.0001；雌性：p = 0.011)。与低密度组(LG)和中密度组(MG)雄性田鼠相比，高密度组(HG)雄性田鼠的存活率显著降低(LG：p＜0.0001；MG：p＜0.0001，图1b)。同样，HG组雌性田鼠的存活率显著低于LG组和MG组(LG：p = 0.041；MG：p = 0.04，图1c)。雌性田鼠在高密度环境下的存活率明显高于雄性田鼠(p = 0.00011，图1d)。

图1. 实验室条件下饲养密度对田鼠寿命的影响。

a)实验设计示意图。b)不同饲养密度下雄性田鼠的存活率。c)不同饲养密度下雌性田鼠的存活率。d)高密度饲养环境下雄性和雌性田鼠存活率的差异。Kaplan-Meier生存曲线经log-rank检验。采用Benjamin-Hochberg校正p值。LG低密度组，n = 14；MG，中密度组，n = 28；HG，高密度组，n = 42。因打斗而死亡的田鼠被排除在数据分析之外。

2饲养密度对应激和生理衰老相关指标的影响

实验2结果表明，不同饲养密度对雄性田鼠应激水平和生理衰老相关指标有显著影响。如图2b所示，MG组(F2，35 = 14，p = 0.004)和HG组(p = 0.002)田鼠血清CORT水平显著高于LG组。在脑组织中，HG组p-p53表达水平(图2c)显著高于LG组(F2，24 = 33.14，p = 0.0017)和MG组(p = 0.0269)；此外，MG组p-p53表达水平也明显高于LG组(p = 0.0351)。HG组田鼠p21表达水平(图2d)显著高于LG组(F2，24 = 15.66，p = 0.0067)。在肝组织中，HG组p-p53和p21的表达水平均显著高于LG组(p-p53：F2，24 = 28.21，p = 0.0025，图2f；p21：F2，24 = 21.53，p = 0.0037，图2g)。HG组田鼠脑和肝细胞的相对端粒长度明显小于LG组(脑：F2，24 = 4.24，p = 0.045，图2e；肝脏：F2，24 = 6.39，p = 0.031，图2h)。HG组小肠中claudin-1的表达水平明显低于LG组(F2，24 = 4.73，p = 0.005，图S1k)。LG组血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)水平显著低于MG组(TNF-α：F2，35 = 14.69，p = 0.002；SOD：F2，8.8 = 9.93，p = 0.008)和HG组(TNF-α：p = 0.002，图S1i；SOD：p = 0.008，图S1d)。HG组白细胞介素-10(IL-10)水平显著高于LG组(F2，6.99 = 16.36，p = 0.002)和MG组(p = 0.019，图S1j)。3个密度组(图S1a，c，e-h)中脑和肝脏的8-OHdG(脑：p = 0.414；肝脏：p = 0.134)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)(脑：p = 0.2658；肝脏：p = 0.2967)和过氧化氢酶(CAT)(大脑：p = 0.8655；肝脏：p = 0.209)水平无显著差异。

使用Y迷宫来确定田鼠的认知功能，该迷宫要求田鼠利用学习和记忆功能向最初有食物的位置移动。统计分析显示，三个密度组供体田鼠对食物臂访问频率(p = 0.2482)、在食物臂累计时间(p = 0.3282)、食物臂访问频率百分比(p = 0.3282)和在食物臂累计时间百分比(p = 0.3372)均无显著差异(图S2a-d，所有p＞0.05)。

图2. 饲养密度对雄性田鼠应激水平及衰老相关参数的影响。

a)实验设计示意图。b)第8周结束时田鼠血清CORT水平。c-e)脑细胞中p-p53和p21的相对表达水平和相对端粒长度。f-h)肝细胞中p-p53和p21的相对表达水平和相对端粒长度。采用线性混合模型确定组间差异，以组为固定因素，不同笼为随机因素。使用emmeans函数进行多重比较检验。* p＜0.05， ** p＜0.01，ns，无统计学意义。LG，低密度组，n = 9；MG，中密度组，n = 9；HG，高密度组，n = 9。RTL是相对端粒长度缩写。

3饲养密度对肠道微生物多样性和功能基因的影响

在实验2中，对从三个密度组的雄性田鼠中收集的33个粪便样本(分别为HG 11个、MG 12个和LG 10个)进行了宏基因组测序。共鉴定出6111种细菌。Shannon指数在三个密度组间无显著性差异(Wilcoxon秩和检验，p = 0.36；图3a)。饲养密度显著影响肠道菌群组成(F2，29 = 2.3，p = 0.02；图3b)。基于Bray-Curtis距离矩阵，观察到不同饲养密度组样本在排序空间中存在明显的分离(图3b)。LG、MG和HG中富集物种数量分别为13、21和22。相比之下，LG、MG和HG组中减少物种数量分别为18、5和1(图3c)。肠道菌群的功能通路也受到饲养密度的影响。本研究确定了114条重要的KEGG Orthology(KO)通路(LG、MG和HG分别61条、28条和25条)和10条重要的碳水化合物活性酶(CAZy)功能通路(LG、MG和HG分别2条、6条和2条)(图3d，e；详情请参见表S1和表S2)。通过DAVID网站将差异KO途径(表S2)转化为GO富集。GO富集显示HG和MG的生物过程富集于糖酵解过程，而LG的生物过程富集于细胞氧化还原稳态(图S3)。为了确定肠道菌群与生理衰老指标之间的整体关系，将每个密度组个体之间肠道微生物群落差异与每个密度组个体之间衰老相关测量值的差异进行相关性分析。Mantel检验显示，静息代谢率、肝脏p-p53和p21蛋白表达、大脑中分化簇38和p-p53蛋白表达、肝脏中sirtuin 1蛋白表达、occludin蛋白表达、脑细胞相对端粒长度等指标与肠道菌群组成显著相关(均p＜0.05，图3f)。这些生理衰老相关指标与KO功能通路无明显关系(图3f)。 采用线性判别分析效应量(LEfSe)筛选三组间相对丰度存在显著差异的菌种(图S4)。Akkermansia muciniphila在LG组中显著富集，Blautia producta在MG组中显著富集。Alistipes属(例如，Alistipes shahii、A. dispar和A. communis)在HG组中显著富集。

测量了结肠粪便中以下六种短链脂肪酸的浓度：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸。LG中丙酸(p = 0.0144)、丁酸(p = 0.0081)、异戊酸(p = 0.0269)和戊酸(p = 0.0089)的浓度高于HG(图S5b、c、e、f)。三组间异丁酸浓度差异无统计学意义(p = 0.3731，图S5d)。

图3. 饲养密度对雄性田鼠肠道微生物群的影响。

a) Shannon指数的差异代表组间alpha多样性的差异；采用Wilcoxon方法分析差异。b) LG、MG和HG样品之间物种水平Bray-Curtis距离的约束主坐标分析(CPCoA)图。c)热图显示差异显著微生物物种(p＜0.01)。虚线框中红色部分物种为富集物种，蓝色部分物种为减少物种。d，e)三元图显示肠道微生物组功能差异(d：KO功能通路；e：CAZy功能通路)。仅显示显著富集的通路。每个点对应一个特定的通路。f)衰老相关测量值之间的成对关系，颜色梯度表示Pearson相关系数。分类和功能群落结构与各项生理指标相关。B是大脑缩写。L是肝缩写。RTL是相对端粒长度的缩写。LG，低密度组，n = 9；MG，中密度组，n = 10；HG，高密度组，n = 11。

4粪便微生物移植对应激及生理衰老相关指标的影响

在实验3中，T-H组(即移植了HG组田鼠粪便微生物的受体田鼠)的血清CORT和TNF-α水平显著高于T-L组(即移植了LG组田鼠粪便微生物的受体田鼠)(图4b，c)。T-H组血清IL-10水平明显低于T-L组(图4d)。T-H组血清8-OHdG和4-HNE水平显著高于对照组(Con)、T-Mz组(即移植了MG组田鼠粪便微生物的受体田鼠)和T-L组(图4e、f、i、j)。相比之下，T-H组组织中CAT(图S6a，b)和SOD水平以及脑和肝细胞相对端粒长度明显低于对照组、T-M组和T-L组(图4g，k)。T-H肝细胞中p-NF-κB p65和COX-2表达水平显著高于T-L组(图4m，n)。T-H小肠中claudin-1的表达水平明显低于T-L组(图S6c)。T-H的脑细胞中p-p53和p21的表达水平显著高于T-L组(图S6d，e)。T-H肝细胞中p-p53和p21表达水平显著高于T-L组和对照组(图S6f，g)。

Y迷宫测试结果显示，三种密度受体田鼠对食物臂访问频率、食物臂访问频率百分比均无显著差异(图S7a，c，所有p＞0.05)。然而，T-H组的食物臂累计时间和食物臂累计时间百分比显著高于T-L组(图S7b，d，所有p＜0.05)，说明T-H田鼠具有较高的记忆和认知能力。

图4. 三种密度组供体田鼠FMT对受体田鼠应激、氧化损伤及相对端粒长度的影响。

a)实验设计示意图。b-d)第4周结束时各组田鼠血清CORT、TNF-α和IL-10水平。e-h)脑组织8-OHdG、SOD活性、4-HNE水平和相对端粒长度。i-l)肝脏中8-OHdG、SOD活性、4-HNE水平和相对端粒长度。m，n) p-NF-κB p65和COX-2在肝脏中的表达水平。T-L，低密度组(LG) FMT受体田鼠，n = 8；T-M，中密度组(MG) FMT受体田鼠，n = 8；T-H，高密度组(HG) FMT受体田鼠，n = 8；对照组，生理盐水，n = 8。组间差异采用单因素方差分析，Tukey事后检验。不共享相同字母的条形图彼此之间有显著差异。

5FMT对肠道微生物多样性和功能基因的影响

实验3的结果显示，FMT显著影响受体田鼠肠道微生物群的α多样性(图5a)。T-L组的Shannon指数显著低于T-H组(Wilcoxon秩和检验，p＜0.05；图5a)。粪便样本分类组成的CPCoA(基于Bray-Curtis距离)显示，FMT组之间有明显分离(F3，31 = 2.17，p = 0.01；图5b)。T-L、T-M和T-H分别有2、3和6个富集物种。相比之下，T-L、T-M和T-H分别有4个、1个和35个减少物种(图5c)。肠道菌群的功能通路也受FMT的影响。我们鉴定了42条关键KO通路(T-L、T-M和T-H分别为3、4和35条)和19条关键CAZy功能通路(T-L、T-M和T-H分别为2、4和13条)(图5d，e)。通过DAVID网站将差异KO通路(表S5)转化为GO富集。GO富集表明T-H的生物过程在固醇生物合成过程和丙酮酸代谢过程中富集，而T-L和T-M中未观察到(图S8)。应激激素水平和一些生理衰老指标(CORT、RTL、CAT、NAD+、SOD、TNF-α、IL-10、8-OHdG、PC和occludin)与肠道微生物组成显著相关(所有p＜0.05)(图5f)。

利用LEfSe筛选对照、T-L、T-M和T-H组相对丰度存在显著差异的菌种。(图S9)。艰难梭菌(Clostridioides difficile)、Roseburia intestinalis和Clostridium hylemonae在T-H中显著富集。Muribaculum属(Muribaculum sp. H5、M. sp. TLL A4和M. nestiinale)在T-L中显著富集。T-M中Prevotella dentalis、P. denticola和Bacteroides dorei显著富集。对照组Bacteroides (Bacteroides salanitronis、B. fragilis和B. viscericola)显著富集。

图5. 三种密度组供体田鼠FMT对受体田鼠肠道微生物群的影响。

a) Shannon指数差异代表组间alpha多样性的差异；采用Wilcoxon方法分析差异。b) Con、T-L、T-M和T-H组样本之间物种水平Bray-Curtis距离的CPCoA图。c)热图显示差异显著微生物物种(p＜0.01)。虚线框中红色部分为富集物种，蓝色部分为减少物种。d，e)三元图显示肠道微生物组功能差异(d：KO功能通路；e：CAZy功能通路)。仅显示显著富集的通路。每个点对应一个特定通路。f)衰老相关测量值之间的成对关系，颜色梯度表示Pearson相关系数。分类和功能群落结构与各项生理指标相关。B是大脑缩写。L是肝缩写。RTL是相对端粒长度缩写。T-L，低密度组(LG) FMT受体田鼠，n = 8；T-M，中密度组(MG) FMT受体田鼠，n = 8；T-H，高密度组(HG) FMT受体田鼠，n = 8；对照组，生理盐水，n = 8。

6干预措施对应激及生理衰老相关指标的影响

实验4评估了两种干预方式对高密度田鼠社会应激和生理衰老相关指标的缓解效果。HR组和HB组(即丁酸给药组)的血清CORT和TNF-α水平明显低于HC组(p＜0.05；图6b，c)。大脑和肝脏中的8-OHdG (p＜0.05；图6d，h)和4-HNE(p＜0.05；图6e，i)，肝脏中p-NF-κB p65和COX-2水平在HR组显著低于HC组(p＜0.05；图6l，m)。HR组脑和肝脏SOD水平显著高于HC组(p＜0.05；图6f，j)。两种干预措施对肝脏和脑细胞的相对端粒长度均无显著影响(p＞0.05；图6g，k)。与HC相比，HB组大脑和肝脏中SOD(p＜0.05；图6f，j)和CAT(p＜0.05；图S10a，d)水平显著升高，而4-HNE水平降低(图6e，i)。两种干预均显著提高血清IL-10水平(p＜0.05；图S10h)。HR单独作用可显著降低脑和肝细胞中p-p53和p21表达水平(图S10b，c，e，f，p＜0.05)。丁酸能显著提高脑内p21的表达(p＜0.05，图S10c)。两种干预对小肠中claudin-1的表达均无显著影响(图S10g，p＞0.05)。

在认知功能方面，HR显著提高了田鼠对食物臂访问频率(p = 0.003)；然而，HB对食物臂访问频率没有显著影响(图S11a，p = 0.078)。相比之下，HB显著增加了食物臂累计时间百分比(t = 2.781，p = 0.014)；然而，HR对食物臂累计时间百分比没有显著影响(图S11d，t = 0.5635，p = 0.582)。同时，这两种干预都没有对食物臂累积时间(HR：t = 0.5303，p = 0.6042；HB：t = 1.590， p = 0.1341；图S11b)和食品臂访问频率百分比(HR：t = 0.9728，p = 0.3472；HB：t = 1.747，p = 0.1025；图S11c)产生显著影响。上述结果表明，HR和HB可在一定程度上改善高密度田鼠的记忆和认知能力。

图6. 不同干预方法对减轻高密度田鼠氧化损伤和炎症的影响。

a)实验设计示意图。b，c)第4周结束时不同干预组田鼠血清CORT和TNF-α水平。d-g)大脑中8-OHdG、4-HNE水平、SOD活性和相对端粒长度。h-k)肝脏中8-OHdG、4-HNE水平、SOD活性和相对端粒长度。l，m) p-NF-κB p65和COX-2在肝脏中的表达水平。HB，高密度丁酸饲喂组，n = 8；HR，高密度缓解组，n = 8；HC为高密度延续组(即无高密度缓解)，n = 8。(a)-(m)的统计分析采用双尾非配对t检验。HC为对照组。* p＜0.05，** p＜0.01，ns：无统计学意义。

讨论

本研究提供了明确的证据，高密度饲养环境加速了田鼠衰老进程，表现为相对端粒长度缩短和DNA损伤增加。本研究还发现，“高密度的微生物群”促进田鼠衰老相关表型的增加。HR和HB干预缓解了社会压力和衰老进程。本研究结果表明，肠道菌群在高密度环境下介导田鼠衰老过程中起着重要作用，并可作为治疗人类应激相关疾病的潜在治疗靶点。

1高密度拥挤对衰老相关过程和寿命的影响

先前的研究表明，高密度拥挤会缩短果蝇和斑胸草雀的寿命，但在哺乳动物中缺乏这样的观察。在本研究中，我们发现高密度居住环境显著缩短了田鼠的寿命。在自然条件下，田鼠寿命约为1年，但在实验室条件下(个人观察)，田鼠最多可存活约3年。由于我们尽量减少其打斗对田鼠死亡率的影响，本研究中观察的寿命变化代表田鼠的自然衰老过程。因此，在高密度环境中加速衰老可能是调节动物种群动态的重要机制，可能是因为拥挤造成了社会压力增加。本研究发现，HG中雌性田鼠存活时间明显长于雄性田鼠。有许多关于雌性和雄性动物寿命差异的报道。例如，Lemaître等人发现雌性哺乳动物，包括人类，寿命明显长于雄性。慢性应激对炎症、氧化和皮质醇反应的影响可能因性别而异，导致男性和女性端粒消减的差异。Powell-Wiley等人发现，在高剥夺条件下，男性端粒下降比女性更显著。高密度可以增加田鼠攻击行为和应激激素(CORT)水平，但对雌性田鼠的影响较少。在野外条件下，一个洞穴系统或一个家庭中，雄性田鼠数量非常少，但雌性田鼠数量多，可能是由于雄性田鼠之间的激烈战斗导致。Zhang等人发现，在高密度环境下，雄性田鼠比雌性有更长的持续攻击时间，这可以解释为什么雄田鼠存活率比雌田鼠低。不同圈养密度对雄性和雌性田鼠肠道微生物多样性均有显著影响，这可能与寿命的性别差异有关。不幸的是，我们没有高密度环境对雌性田鼠衰老相关过程和肠道微生物影响的数据，这需要在未来进一步研究。高密度拥挤会增加社会压力(如CORT水平)，然后可能加速人类和动物衰老。长期服用CORT导致大鼠过早衰老。本研究结果显示，HG的血清CORT水平明显较高，这与之前的观察结果一致，支持了我们的第一个假设。因此，高密度田鼠社会压力相关激素增加可能是加速衰老相关过程的驱动因素。 先前的研究表明，压力或恶劣的生活条件可以缩短端粒长度。转录因子p53被端粒消减和DNA氧化损伤激活。在p53依赖性早衰中，细胞周期阻滞受p21调控。在本研究中，我们发现HG在三个密度组中具有最短的相对端粒长度，并且高密度与田鼠大脑和肝脏p-p53和p21的过表达有关。因此，作者认为高密度拥挤胁迫可能通过调节p-p53和p21促进衰老相关过程。8-OHdG是最常见的氧化性DNA损伤标志物之一，其在许多组织中的累积量随着年龄的增长而增加。4-HNE是一种脂质过氧化产物，被认为是衰老相关氧化应激的标志。在本研究中，高密度对供体田鼠8-OHdG和4-HNE水平无显著影响；然而，在FMT受体田鼠中观察到8-OHdG和4-HNE水平出现差异。高密度拥挤导致血清TNF-α和IL-10水平分别显著升高和降低。如前所述，慢性炎症与衰老有关。这可能是由于高密度胁迫下肠道微生物组成被破坏，导致肠道屏障通透性增加(claudin-1表达下调)。这导致微生物及其代谢产物通过肠道屏障渗漏，随后导致不必要的炎症和DNA损伤。本研究结果表明，高密度增加了肠道通透性，导致促炎因子和抗炎因子之间失衡，这可能加速了田鼠衰老相关进程。

2高密度条件下肠道菌群与应激和衰老相关指标的关系

A. muciniphila在低密度田鼠中富集。以往的研究表明，A. muciniphila在老年小鼠中丰度较低，其参与丁酸合成途径的程度降低。口服A. muciniphila可改善衰老小鼠肠道表型，延长其健康寿命。Prevotella丰度增加是食蟹猴衰老的标志。减少Alistipes和Prevotella相对丰度可能是一种抗衰老的方法。在本研究中，发现HG中Alistipes(如A. shahii、A. dispar、A. communis)和Prevotella富集。而抗衰老益生菌Propionibacterium freudenreichii和Streptococcus macedonicus的相对丰度在HG田鼠中较低。肠道菌群可以通过积极的刺激来补偿或支持身体的衰老过程。LG和MG都有丰富可产生短链脂肪酸的细菌，从而减少炎症，保持肠道菌群稳定。例如，Blautia和Eubacterium可以产生乙酸和丁酸。值得注意的是，在粪便短链脂肪酸的测定中，我们还发现LG粪便中乙酸、丙酸和丁酸浓度显著高于HG粪便。丁酸有抗衰老作用。衰老通常与Akkermansia和产生丁酸的细菌丰度减少以及肠道完整性受损有关。本研究结果表明，这种特定的抗衰老或抗炎或益生菌可能在调节田鼠密度依赖性衰老过程中发挥重要作用。

3高密度环境下肠道菌群可能介导衰老相关过程

最近的研究表明，将年轻小鼠肠道菌群移植给老年小鼠，可以逆转肠道、眼睛和大脑的衰老特征。相反，将老年小鼠肠道菌群移植给年轻小鼠，会引起大脑和眼睛炎症。目前尚不清楚“高密度微生物群”是否可以通过FMT加速动物衰老相关过程。在本研究中，我们发现“高密度微生物群”诱导了受体田鼠小肠CORT和claudin-1水平、p-p53和p21表达水平、脑和肝细胞相对端粒长度、抗氧化水平(SOD)和炎症失衡(血清TNF-α和IL-10水平)的类似变化。本研究的结果表明，肠道微生物可能在调节动物衰老相关过程中发挥重要作用。在密度处理下，供体田鼠(实验2)和受体田鼠(实验3)的衰老相关指标略有差异。尽管8-OHdG和4-HNE水平在不同密度组供体田鼠中没有显著差异，但在T-H组中这些水平显著升高(表S3)。这种差异表明T-H田鼠氧化和抗氧化不平衡(8-OHdG和4-HNE水平增加，SOD和CAT水平下降)。肠道微生物组成失调可能是导致氧化和抗氧化失衡的关键因素。肠道微生物组成改变可能是由于NF-κB表达增加或NF-κB激活而引起炎症和氧化损伤，NF-κB上调COX-2。NF-κB-COX-2-ROS轴慢性激活导致衰老加速。本研究的结果表明，HG供体田鼠的肠道菌群显著上调了受体田鼠的NF-κB和COX-2表达水平，从而支持了我们的第二个假设。在高密度环境下，肠道菌群可能通过增强NF-κB和COX-2通路介导的DNA氧化损伤来促进衰老相关过程。这也意味着维持肠道菌群稳态和抑制DNA损伤可能是一种有效的干预策略。先前的研究报告称，Adlercreutzia既有有害影响也有有益的影响。在本研究中，HG和T-H的Adlercreutzia丰度都较高，这表明Adlercreutzia可以在高密度环境下促进衰老。艰难梭菌在T-H中显著富集，也可能促进衰老，因为抑制艰难梭菌有利于健康衰老。值得注意的是，在T-H中发现了大量产生丁酸的细菌，如R. testinalis、Butyrivibrio和Eubacterium rectale。肠道菌群可以适应宿主的反向生理变化。在高密度条件下，产丁酸菌在T-H中富集可用于修复DNA损伤或炎症；在实验4中观察到类似的干预缓解效果。此外，Leptotrichia_sp._oral_taxon_212和Gordonibacter_pamelaeae在T-H田鼠中丰度增加，而Bacteroides_uniformae丰度下降。Leptotrichia_sp._oral_taxon_212可引起多种感染，是一种机会性病原体，可对免疫力低下的宿主产生多种负面影响。Gordonibacter_pamelaeae也可引起多种感染，包括菌血症，并与克罗恩病有关。Bacteroides_uniformis可以增强肠道屏障，减轻炎症。这些病原体丰度增加和抗衰老细菌比例下降可能是导致高密度田鼠氧化损伤增加的因素之一，包括促炎反应。供体田鼠和受体田鼠所处环境不同，将会导致不同饲养密度下肠道菌群(图3a和5a)和GO富集结果(图S1和S8)的差异。供体田鼠通过社会接触和下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴心理感知感受高密度拥挤胁迫。相比之下，受体田鼠通过接受供体田鼠肠道微生物群和粪便代谢产物直接经历高密度饲养胁迫。此外，是否使用抗生素预处理也是造成供体田鼠和受体田鼠上述反应差异的关键原因。作者之前的研究表明，受体田鼠的预处理也可能通过改变肠道微生物群来改变GO通路。本研究发现HG田鼠氧化损伤和炎症增加糖酵解的富集有关，这与之前的研究一致，即氧化应激和炎症增加可以促进宿主糖酵解。T-H田鼠FMT后甾醇合成生物过程与HG田鼠有显著差异。众所周知，固醇合成与动物和人体的健康密切相关。比如，高水平胆固醇可导致各种疾病(如心血管疾病)，并可能促进衰老相关过程。许多细菌可以合成固醇，而细菌产生的固醇不同于脊椎动物。抗生素预处理可能通过塑造优先效应的方向，帮助高密度饲养组FMT肠道菌群定植，从而影响肠道菌群的群落结构，进而促进细菌甾醇合成，导致T-H田鼠Shannon多样性指数显著提高(图3a和5a以及图S1和S8)。

4应激干预对衰老相关过程的影响

一些研究表明，压力引起的衰老是可逆的。例如，缓解压力有助于将白发变成黑发，个人情绪调节和自我控制可以缓解年轻人群中与衰老相关的压力。当前的研究还表明，HR方法显著减轻了社会压力，缓解了与肝脏衰老相关的过程。HB和HR方法也显著改善了田鼠的记忆功能。先前的研究报告称，丁酸盐可以帮助老年小鼠对抗衰老的一些影响，并延缓衰老。在本研究中，我们发现补充丁酸可以缓解高密度拥挤引起的衰老症状，支持了我们的第三个假设。虽然HB和HR法都能有效缓解高密度胁迫引起的田鼠衰老相关过程，但其机制可能存在差异。由于器官衰老是不同步的，不同器官对衰老干预的反应可能不同。本研究的结果显示，与HB相比，HR的p-p53和p21表达显著下调。HB上调了SOD水平，表明丁酸减缓加速衰老的机制可能与其抗氧化特性有关。通过HR干预缓解衰老相关过程可能是由促炎水平的正常化和HPA轴的活性介导。值得注意的是，HB和HR干预都下调了COX-2的表达，这表明它们可能通过调节COX-2表达和改善氧化损伤引起的失衡来影响DNA损伤。因此，可以通过恢复肠道菌群稳定性(即增加有益菌比例，降低有害菌比例)和抑制NF-κB和COX-2表达水平上调来抑制胁迫驱动的衰老相关过程。有必要选择综合干预方法，有效缓解应激对健康的不良影响。为了有效缓解压力对健康的不良影响，有必要选择综合干预方法。

结论

综上所述，高密度拥挤可能通过衰老相关生理过程缩短个体寿命。高密度增加应激激素CORT的水平，通过减少抗衰老或抗炎细菌物种丰度和增加致病菌比例，破坏肠道微生物群组成，从而通过上调NF-κB和COX-2通路导致DNA氧化和炎症增加(图7)。HR干预通过降低应激水平和抑制NF-κB和COX-2通路来缓解衰老相关过程，而HB干预通过改善高密度田鼠肠道健康和下调NF-κB和COX-2的表达来缓解衰老相关过程(图7)。

图7. 高密度拥挤胁迫和干预(高密度缓解和丁酸给药)对田鼠衰老相关过程的影响及其潜在机制示意图。

用不同颜色表示不同的影响因素。红色箭头和加号表示高密度应激作用。绿色箭头和减号表示丁酸给药作用。紫色箭头和减号表示高密度缓解作用。箭头的方向表示作用的目标分子或器官。加号或减号分别表示促进或抑制。本研究存在一些局限性。首先，本研究主要集中在衰老的生理过程上，行为或形态老化表型没有得到充分评估。其次，尽管来自HG供体田鼠的FMT可以在受体T-H田鼠中产生类似的衰老相关过程，但所识别的微生物或途径的潜在机制尚不清楚。第三，虽然HR和HB干预可以逆转成年田鼠的衰老相关过程，但目前尚不清楚它们是否能在寿命方面逆转衰老。未来研究应确定在调节动物密度依赖性衰老过程中发挥作用的关键细菌及其代谢产物。最后，雄性的结果可能与雌性不同。我们没有选择雌性的原因是雌性大约有一周的发情周期，这会改变她们的激素水平和肠道菌群。因此，使用雌性会给处理效果带来不确定性或更大的变化。在研究期间，雄性在生理上比女性更同质。此外，在高密度环境下，雄性会比雌性承受更大的压力，因为雄性比雌性更具攻击性。预计高密度对雌性的拥挤效应应该小于雄性，因为雌性在洞穴系统中对彼此的容忍度更高。本研究可能对管理人类健康或动物种群有一些启示。生活在人口密度高的大城市，社会压力大，患精神病、抑郁症等精神疾病的风险高，端粒长度短。肠道菌群可以作为一种潜在的治疗靶点，以缓解与人类压力相关的疾病症状。抑制致病菌(如Alistipes、C. difficile、Leptotrichia_sp._oral_taxon_212和Gordonibacter_pamelaeae)或给予益生菌(例如，Bacteroides_uniformis和A. muciniphila)或产生短链脂肪酸的细菌(例如，R. intestinalis、Butyrivibrio和E. rectale)可以帮助抵抗和改善健康状况的下降。此外，通过适当放松缓解压力可能是缓解高密度衰老的有效方法。田鼠的数量每5-7年爆发一次，经常对草原造成巨大破坏。选择有害菌或致病菌可减少草原田鼠种群暴发。未来需要进一步的工作来评估这些肠道微生物在管理人类健康或动物种群方面的可行性。