产前应激通过海马齿状回TERT调控子代的HPA轴功能稳态

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背景BACKGROUND

妊娠期间，母体暴露于压力刺激会重塑后代的下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴。HPA轴是机体应对紧急应激的重要适应系统，但其慢性激活会对机体造成损害。大量证据表明，HPA轴的过度活化与青少年抑郁症的病理相关。产前应激也会引起的过多糖皮质激素穿过胎盘，损害胎儿HPA轴发育，改变HPA轴功能稳态。然而目前对于产前应激引起的胎儿HPA轴功能障碍的分子机制尚未明确。

海马是HPA轴功能调节的重要组成部分，参与了应激反应的负反馈调节。广泛表达的糖皮质激素的内源性受体，即糖皮质激素受体（GR）在海马中密度最高。海马GR激活可抑制PVN促肾上腺皮质激素释放因子或激素（CRF或CRH）的表达，从而进行负反馈调节，使肾上腺皮质醇分泌减少。前人研究表明，抑郁症患者中GR数量减少和/或功能受损，且GR的表达减少和功能受损也与产前应激导致后代HPA轴反应性增强有关。但是目前否存在除GR之外的机制来维持HPA轴的稳态仍然不清楚。

端粒酶是由高度保守的催化性端粒酶逆转录酶（TERT）、端粒酶RNA（TERC）和一系列物种特异性蛋白质组成的复合物。在早期逆境的儿童中观察到端粒长度的加速减少。产前应激也会导致后续子代青少年时期端粒长度缩短。在本研究中，作者揭示了海马齿状回（DG）中TERT是调节HPA轴活性的独立因素。

结 果RESULTS

Tert敲除引起HPA轴高活性但不影响GR水平

为探究TERT是否参与调节HPA轴活性，作者使用了Tert敲除鼠（Tert−/−）。与野生型小鼠（WT）相比，Tert−/−小鼠下丘脑PVN中CRF蛋白和mRNA含量增高。作者使用Crf-Cre和Tert−/−小鼠品系配种后得到以下转基因小鼠：Crf-Cre; Tert+/−，Crf-Cre; Tert−/−或Crf-Cre; Tert+/+小鼠。在这些转基因鼠的PVN中注射AAV-DIO-GFP观察CRF神经元的数量（即GFP阳性细胞），可见Crf-Cre; Tert−/−，Crf-Cre; Tert+/−和Crf-Cre; Tert+/+小鼠的CRF区域中GFP阳性细胞数量支持基因剂量依赖效应。

血浆中糖皮质激素水平升高是HPA轴活性增强的标志。与WT小鼠相比，Tert−/−小鼠的血浆中皮质酮（CORT）水平明显升高。为探究HPA轴的负反馈效应，作者使用了地塞米松（DEX）抑制试验。WT小鼠中，DEX处理后血浆中的CORT水平下降，然而，Tert−/−小鼠在予以DEX后未能抑制血浆中CORT的升高。ELISA检测也提示Tert−/−小鼠的血浆中促肾上腺皮质激素（ACTH）浓度较高，不受DEX的抑制（图1g）。综上所述， Tert敲除导致TERT缺乏引起了HPA轴的高活性。

此外，盐皮质激素受体（MR）在边缘神经元中也参与维持HPA轴的稳态。作者结果发现Tert敲除对涉及抑郁症的海马、前额叶皮层、下丘脑和杏仁核等区域的GR和MR的表达没有影响（图1h-k）。这些观察结果表明，TERT对HPA轴的调节机制不依赖于GR和MR。

图 1

TERT调控HPA轴在负面和正面应激的响应

为评估DG中TERT缺失对HPA轴功能障碍的影响，作者构建了携带小鼠全长Tert互补DNA和EGFP报告基因的逆转录病毒，将RV-TERT-EGFP或RV-EGFP注入5周龄（青春期）Tert−/−和WT小鼠的海马DG区。下丘脑CRF蛋白水平以及血浆CORT水平表明，在发育中DG区补充TERT显著逆转了Tert−/−小鼠HPA轴功能障碍。DEX抑制试验和ACTH测定也表明，在TERT在DG区重新表达2个月后，DEX处理降低了Tert−/−小鼠血浆中CORT的水平。在PVN区域测量CRF阳性细胞也显示了相同的效果。

在应对急性应激时，HPA轴会短暂激活，使得体内糖皮质激素水平升高。海马中增加的糖皮质激素会对HPA轴进行负性调节，以维持内源性糖皮质激素节律。为了解DG中的TERT是否参与急性应激下HPA轴负性调节这一过程，作者外源性予以RV-TERT-EGFP或RV-EGFP注入到5周龄Tert−/−和WT小鼠的DG区。注射后两个月予以小鼠1h束缚应激，收集应激暴露后0.5、1和5h的血浆样本。结果显示WT小鼠中，CORT浓度在0.5h和1h增加，5h恢复正常。而Tert−/−小鼠中，CORT浓度在所有时间点持续升高，并且应激后5h未恢复到生理水平。需要注意的是，Tert−/−小鼠DG区重新表达TERT后，以上变化被逆转（图2f）。此外，DG区中GR和MR的表达没有受到影响（图2g）。然而，在成年期的20周龄Tert−/−小鼠DG区中注入RV-TERT-EGFP无法挽救HPA轴功能障碍（补充数据）。这些结果表明，在发育中的DG区，TERT对于成年期正常的HPA轴功能至关重要。

性行为被视为一种正向应激，作者测量了雄性WT和Tert−/−小鼠在性行为后0.5h、1h和5h的血浆CORT水平（图2h）。结果发现WT小鼠在不同时间点血浆CORT保持不变，表明正常生理状态下HPA轴对这种正向应激没有波动。然而Tert−/−小鼠在性行为后0.5h和5h血浆CORT水平升高（图2h）。以上结果表明，缺乏TERT状态下，正向应激引发了HPA轴的异常强烈应激反应。

图 2

DG区TERT调节HPA轴活动，不依赖于GR

为研究DG区的TERT的作用，作者构建了LV-TERT-shRNA-GFP (shTERT)，将其注入5周龄小鼠DG区，2个月后观察到DG区TERT选择性沉默导致PVN中c-FOS阳性细胞数量显著增加（图3a），下丘脑CRF过度表达及血浆中CORT水平升高（图3b，c）。相反，作者使用LV-TERT-EGFP在DG区过度表达TERT后，发现HPA轴活动被抑制，PVN区域中c-FOS阳性细胞数量减少（图3d），下丘脑中CRF合成降低（图3e）及血浆中CORT水平的升高（图3f）。值得注意的是，无论TERT沉默还是过表达，都没有改变DG区中GR和MR的表达（图3g, h）。

TERT在其催化活性之外还具有其他功能。为明确调节HPA轴活性是否需要端粒酶活性，作者构建了携带TERT cDNA突变的重组慢病毒载体（LV-TERTΔ-EGFP）来表达非活性TERT。在予以该病毒注射后，发现未改变下丘脑PVN区域神经元的活性（图3i）和血浆中CORT的浓度（图3j）。在5周龄小鼠DG区持续一周予以端粒酶抑制剂叠氮胸苷（AZT），在给药结束后24h检测小鼠下丘脑中CRF表达和血浆中CORT浓度发现没有改变（补充数据），但在结束给药后2个月CRF和CORT浓度明显增加（补充数据）。同样AZT给予后GR和MR的表达没有改变。AZT实验表明，端粒酶活性被抑制后仅对HPA轴活动产生远期影响。

综上，端粒酶的催化活性本身与HPA轴功能障碍无关，但发育中的DG区中端粒酶活性抑制后可能引起远期HPA轴异常。GR和MR并没有参与这一过程。

图 3

颗粒细胞的低兴奋性导致了TERT缺乏引起的HPA轴功能障碍

作者先前研究发现，Tert−/−小鼠中海马齿状颗粒细胞（DGC）的发育受到损害。单细胞膜片钳记录显示，与WT小鼠相比，Tert−/−小鼠DGC放电率显著降低（图4a）。为探究TERT和DGC的神经元兴奋性在调节HPA轴中的因果关系，作者予以5周龄Tert−/−小鼠DG区AAV-hM3Dq-mCherry微注射，在1月后给予CNO处理（图4b）。结果观察到，CNO处理后Tert−/−小鼠DG区DGC被迫激活（图4c）。相应地，Tert−/−小鼠在接受AAV-hM3Dq-mCherry微注射后，HPA轴的活动被抑制（图4d）。

此外，作者将POMC-Cre小鼠与ROSA26-hM4Di小鼠交配，产生POMC-Cre; hM4Dif/+小鼠，POMC启动子在发育中的DGC中驱动Cre重组酶，使DGC中hM4Di受体的表达。在予以该品系小鼠DG区CNO激活后，hM4Di受体将抑制DGC的神经元活动（图4e）。因此作者先予以POMC-Cre; hM4Dif/+小鼠LV-TERT-EGFP注射以过表达TERT，在2个月后在双侧DG区使用CNO激活（图4f），观察到TERT过表达显著增加了DG区c-FOS+细胞数量，降低了血浆CORT水平（图4g, h）。但当CNO给药后TERT过表达的效应被阻断（图4g, h）。以上结果提示，产前应激引起的TERT缺乏以及由此引起的DGC的低兴奋性可能导致后代异常的HPA轴活动稳态。

图 4

DG区的TERT缺乏导致产前应激引起子代成年后代HPA轴功能障碍

为了研究Tert基因功能性多态性与抑郁症遗传相关性，作者使用单核苷酸多态性在中国人群中进行了病例对照样本的遗传关联分析。259例重度抑郁障碍（MDD）患者和196名健康对照者（Hcs）的人口统计学和临床特征列在表1中。年龄（t = 0.886，P = 0.378）和性别（χ2 = 3.8，P = 0.051）之间没有统计学上显著的差异。结果未发现hTert的大多数核苷酸多态性位点与抑郁症之间的关联，除了rs2736099位点。两组中等位基因频率符合Hardy-Weinberg平衡。三个基因型（AA，AG，GG）的分布在MDD患者和Hcs之间有差异（P = 0.022，逻辑回归校正年龄和性别）。如表2所示，在MDD患者中，A等位基因的突变率显著更高（P = 0.009）。单因素方差分析显示在Hamilton抑郁量表总分（F = 6.766，P = 0.001）以及HAMD因子2（体重，F = 3.049，P = 0.049），HAMD因子3（认知，F = 4.14，P = 0.010），HAMD因子5（阻滞，F = 3.16，P = 0.044），HAMD因子6（睡眠症状，F = 6.534，P = 0.002）和HAMD因子7（绝望，F = 3.094，P = 0.040）之间存在显著差异。rs2736099的A等位基因携带者在HAMD-1/2/3/5/6/7和GG组中得分显著较高。这些来自临床样本的结果表明，TERT功能异常与抑郁症的病理过程相关。

表5

母体应激和产前糖皮质激素暴露会损害胎儿HPA发育编程。为研究产前应激后子代海马区TERT的表达水平，作者予以孕鼠产前慢性应激（连续两周予以束缚和光刺激），检测新生子代和出生后3月海马区TERT mRNA水平（图5a）。产前母体应激显著降低了新生子代海马区颗粒状DG区TERT mRNA水平（图5a），并导致成年后代中TERT水平持续降低（图5a）。通过在孕期应激暴露前30分钟给予CORT合成抑制剂metyrapone（每天1次，连续两周），发现产前过度糖皮质激素的暴露是导致DG区TERT表达异常（图5b）和子代HPA轴功能紊乱（图5c）的主要因素。

产前应激经历的胎儿中特定CpG位点的DNA甲基化会导致基因在子代中异常转录。Tert基因的启动子和外显子1区域存在2个CpG岛，含有35个位点（图5d）。作者通过BSAS分析，测量了成年后代DG区这些位点的甲基化状态。产前期的应激导致Chr13:73764379位点高甲基化和Chr13:73764526位点低甲基化，而抑制母体体内过度糖皮质激素合成则可以阻止这种甲基化状态（图5e）。为探究该机制，作者构建了Tert基因启动子（pTERT）或Chr13:73764379位点突变（CG→AG）的Tert基因启动子（pTERT379mut）的荧光素酶报告载体。使用293 T细胞转染对照质粒pTK、质粒pTERT或质粒pTERT379mut进行荧光素酶实验。意外的是，CORT孵育和Chr13:73764379位点的单核苷酸突变并没有影响Tert基因的启动子活性（图5f），表明该核苷酸在TERT表达调控中不参与。该位点的甲基化水平与母体应激引起的TERT缺乏无关。

在探究Chr13:73764526位点低甲基化对TERT转录表达的影响时，作者通过在腺病毒载体中构建含有同义突变（C→A）的AD-TERT526mut-GFP（图5g）。将Tert-/-小鼠海马神经干细胞（NSCs）细胞分别感染了AD-TERT-GFP、AD-TERT526mut-GFP或AD-GFP 4天。在AD-GFP感染的Tert-/- NSCs中，未检测到TERT mRNA和活性的存在，而AD-TERT526mut-GFP感染后的4天，TERT的表达和活性明显下降。与AD-TERT-GFP感染相比（图5g，h），表明Chr13:73764526位点的低甲基化可能参与了TERT异常表达。为选择性编辑Chr13:73764526位点的DNA甲基化，作者利用TALE系统构建了将dCas9与甲基化/去甲基化途径酶融合的LV-Tert526-SV40-DNMT3A或LV-Scramble-SV40-DNMT3A，以靶向Chr 13:73764526 CpG位点，而不改变DNA序列。在经历产前应激的5周龄子代小鼠DG区进行微注射后的2个月，Tert的Chr 13:73764526位点的低甲基化状态以及DG区中的TERT水平得到了逆转（图5i）。此外，LV-TERT-EGFP的微注射使DG区中TERT的水平恢复正常，但并未影响GR和MR的表达（图5j-k）。结果表明，DG区TERT的补充抵消了产前应激对子代HPA轴功能的多种影响（图5l）。

此外，与WT小鼠相比，Tert-/-小鼠颗粒状层中c-FOS阳性细胞的数量明显较低（图5m，n）。急性应激（1h束缚）增强了WT小鼠DGC活性，但未对Tert-/-小鼠产生影响。成年期的急性应激未能激活经历产前应激的WT和Tert-/-小鼠的DGC（图5m，n）。这些结果表明，DG区的TERT缺乏通过影响DGC的神经元活动，介导产前应激引起的子代HPA轴功能障碍。

图 6

总结CONCLUSION

本研究发现海马中端粒酶逆转录酶（TERT）基因敲除引起HPA轴的高活性，但该过程不依赖于糖皮质激素受体（GR）。作者认为发育阶段海马齿状回（DG）中的TERT水平决定了成年期HPA轴对压力事件的反应，通过调节颗粒细胞（DGCs）的兴奋性而不是GR的表达。研究还表明，产前高水平的糖皮质激素暴露诱导了小鼠Tert基因第1外显子（Chr13：73764526）位点的低甲基化，导致DG中TERT的缺乏以及成年子代中的HPA轴异常。本研究揭示了独立于GR因素的产前应激相关的HPA轴功能损伤机制，为了解维持HPA轴稳态的机制提供了新的视角。

原始文献：

Wu M, Li A, Guo Y, Cao F, You S, Cao J, Mi W, Tong L. GABAergic neurons in the nucleus accumbens core mediate the antidepressant effects of sevoflurane. Eur J Pharmacol. 2023 May 5;946:175627. doi: 10.1016/j.ejphar.2023.175627. Epub 2023 Mar 1. PMID: 36868292.

排版：蒋明

校审：方芳  缪长虹

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编辑：Michel.米萱

校对：MiLu.米鹭