外泌体在M1型小胶质细胞诱发神经元损伤中的作用

神经元是大脑中的效应细胞，与小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及神经血管系统相互作用，维持中枢神经系统的稳态[1]。小胶质细胞在调节神经元功能方面发挥着重要作用，小胶质细胞和神经元之间的交流是使大脑活动与各种功能同步的关键[2]。小胶质细胞受到刺激后，激活极化为促炎(M1型)或抗炎(M2型)两种表型[3]。M1型小胶质细胞能释放促炎因子，启动炎症反应，引起细胞凋亡及继发损伤[4]。研究表明，小胶质细胞与神经元的相互作用大多数是由细胞间信号通路介导的，外泌体作为细胞间通讯的载体，可以介导细胞间的信息传递及信号调控[5,6]。然而，外泌体是否作为M1型小胶质细胞诱发神经元损伤的媒介尚不清楚。本研究拟评价外泌体在M1型小胶质细胞诱发神经元损伤中的作用，为神经系统相关疾病的防治及其机制提供实验依据。

材料与方法

细胞培养及鉴定

小鼠神经母细胞瘤细胞系(N2a细胞)由武汉普诺赛生命科技有限公司提供，用含10%胎牛血清(Gibco公司，美国)、1%青霉素链霉素抗生素(HyClone公司，美国)高糖MEM(武汉普诺赛生命科技有限公司)培养液，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，待细胞达到对数生长期(密度约80%～90%)时，用0.25%胰酶消化细胞并吹打成单细胞悬液，按照1∶2或1∶3的比例进行传代。BV2小胶质细胞株由科赛公司提供，用含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素抗生素的DMEM/F12(Gibco公司，美国)培养液培养，加入脂多糖(Abcam公司，美国)100 ng/ml和干扰素γ(Abcam公司，美国)20 ng/ml孵育24 h诱导小胶质细胞极化为M1表型。然后更换正常的DMEM/F12培养基培养24 h后，收取上清液，分别采用免疫荧光法和PCR法检测M1型小胶质细胞表面标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及其mRNA表达水平，对M1型小胶质细胞进行鉴定。 

外泌体提取和鉴定

生长良好的M1型小胶质细胞用PBS清洗2次，更换为含10%无外泌体的血清(SBI公司，美国)的DMEM/F12培养基(BI公司，以色列)，培养24 h后收取上清。采用ExoQuick-TC™试剂盒(SBI公司，美国)提取外泌体，提取的外泌体用PBS溶解，－80 ℃保存。将外泌体重悬液置于涂有碳涂层的300网铜网格上，室温下干燥5 min，用2%磷钨酸滴染色10 min。采用HT7700透射电子显微镜(Hitachi公司，日本)观察外泌体形态，纳米颗粒粒径分析评估分离的外泌体直径分布，Western blot法测定外泌体表面标志物CD9、CD63和热休克蛋白70(HSP70)的表达水平，对外泌体进行鉴定。 

细胞分组和处理

将生长良好的N2a细胞采用随机数字表法分为4组(n＝24)：对照组(C组)、M1型小胶质细胞组(M组)、外泌体组(E组)和外泌体抑制剂+M1型小胶质细胞组(G+M组)。C组常规培养24 h；M组加入M1型小胶质细胞上清液2 ml培养24 h；E组加入100 μg/ml M1型小胶质细胞源性外泌体2 ml培养24 h；G+M组用含有外泌体抑制剂GW4869 (上海宇玫博生物科技有限公司)10 μmol/L的细胞培养基培养24 h后收取细胞上清液，加入到N2a细胞中培养24 h。

CCK-8法检测细胞活力　将处理后的N2a细胞制成单个细胞悬液，以1 000个/孔细胞的密度接种于96孔板，每孔中加入100 μl高糖MEM培养基，37 ℃、5%CO2-95%O2培养24 h。每组取6孔，加入10 μl CCK-8溶液(上海碧云天生物科技有限公司)孵育1 h，采用多功能酶标仪(PerkinElmer公司，美国)测定波长450 nm处的吸光度值，以此反映细胞活力。

流式细胞术检测细胞凋亡情况　

使用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。取对数生长期N2a细胞，以1×106个/孔接种于6孔板上。分组处理后用不含EDTA的胰酶(北京索莱宝生物科技有限公司)消化成单细胞悬液；采用Annexin V-FITC/PI试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)进行染色，使用流式细胞仪(Beckman Coulter公司，美国)检测细胞凋亡情况。

qRT-PCR法检测细胞Bcl-2和Bax的mRNA表达水平 　

取对数生长期的N2a细胞，以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，分组处理后，采用RNA提取试剂盒(Takara公司，日本)提取RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher公司，美国)检测提取RNA的浓度和纯度，OD260/OD280≥1.8的样品用于后续检测。按照逆转录试剂盒(Takara公司，日本)说明书逆转录成cDNA。用qRT-PCR试剂盒(Takara公司，日本)检测CD32和iNOS的mRNA表达水平，以GADPH作为内参，以cDNA为模板进行扩增。引物由上海生工生物有限公司合成，Bcl-2上游引物：5′-TGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，下游引物：5′-TGAGCAGGGTCTTCAG-AGACAG-3′；Bax上游引物：5′-TGTCTCCGGCGAATTGGAGA-3′下游引物：5′-CCAGTTGAAGTTGCCATCAGC-3′；GADPH上游引物：5′-AGGAGCGAAGACCCCACTAACA-3′，下游引物：5′-AGGGGGGCTAAG-CAGTTGGT-3′。PCR反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。采用2－ΔΔCT法计算相对表达量。

Western blot法检测细胞Bcl-2和Bax的表达水平　

将N2a细胞以3×105个/孔的密度接种于6孔板，各组处理完后，加入稀释后的蛋白酶抑制剂PMSF(北京索莱宝科技有限公司)的RIPA裂解液，充分裂解细胞后收集裂解液，4 ℃、10 000×g离心5 min，取上清液。BCA法测定蛋白质浓度，根据说明书配置分离胶和浓缩胶。在蛋白质样品中加入2×SDS-PAGE上样缓冲液(含DTT)，混匀，100 ℃煮沸5 min使蛋白变性，复温后离心收集上清液，加入到SDS-PAGE加样孔中电泳。湿转法转膜成功后，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用1×TBST洗膜3次。分别加入Bcl-2抗体(1∶1 000)、Bax抗体(1∶5 000)和β-actin抗体(1∶7 500)(Abcam公司，英国)4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1 000，北京中杉金桥科技公司)室温孵育1 h，ELC发光，曝光显影。采用Quantity One图像分析软件(Bio-Rad公司，美国)测定条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达。

统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差( ±s)表示，不同类型细胞间比较采用两独立样本t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结　果

与M0型小胶质细胞比较，M1型小胶质细胞iNOS和CD32及其mRNA表达上调(P<0.05)，证明成功诱导BV2小胶质细胞极化为M1表型。见表1。

表1 M0与M1型小胶质细胞iNOS和CD32及其mRNA表达的比较(n＝3， ±s)

注：iNOS为诱导型一氧化氮合酶

透射电镜结果显示：M1型小胶质细胞上清液提取出外泌体颗粒呈圆形，具有双层膜结构；纳米颗粒粒径分析结果显示：外泌体尺寸约为40～160 nm；Western blot结果显示：外泌体存在特异性外泌体标记蛋白CD9、CD63和HSP70的表达。上述结果表明，外泌体成功地从M1型小胶质细胞上清液中分离出来。见图1，图2。

图1 M1型小胶质细胞的外泌体透射电镜图

图2 外泌体标志物CD9、CD63和HSP70表达的电泳图

注：HSP70为热休克蛋白70

与C组比较，其余3组细胞活力降低，细胞凋亡率升高(P<0.05)；与M组比较，G+M组细胞活力升高，细胞凋亡率下降(P<0.05)，E组和M组细胞活力和细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 四组细胞活力和凋亡率的比较(n＝6， ±s)

与C组比较，其余3组细胞Bcl-2及其mRNA表达下调，Bax及其mRNA表达上调(P<0.05)；与M组比较，G+M组细胞Bcl-2及其mRNA表达上调，Bax及其mRNA表达下调(P<0.05)；E组和M组细胞Bcl-2、Bax及其mRNA差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图3。

图3 四组细胞Bax和Bcl-2表达的电泳图

注：Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白

表3 四组细胞Bcl-2、Bax及其mRNA表达的比较(n＝6， ±s)

注：Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白

讨　论

小胶质细胞是中枢神经系统内的固有免疫效应细胞，与T淋巴细胞、B淋巴细胞等细胞共同参与神经损伤后的免疫反应，是调节神经炎症反应的重要靶点[7]。小胶质细胞极化的类型决定了神经炎症的方向[8,9]。M1型小胶质细胞在体外可被IFN-γ和LPS激活，释放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎介质，启动炎症反应，具有明显的神经毒性作用[10]。本研究应用的BV2小胶质细胞是最常用的原代小胶质细胞替代品，加入IFN-γ和LPS后，M1型小胶质细胞表面标志物CD32和iNOS及其mRNA表达上调，证明成功诱导了M1型小胶质细胞活化。本研究参照文献[11]将M1型小胶质细胞的上清液与N2a细胞共培养24 h，结果表明，与C组比较，M组细胞活力下降，细胞凋亡率升高，提示M1型小胶质细胞诱发了神经元损伤。

外泌体是由不同细胞类型分泌的具有脂质双分子层的细胞外囊泡，直径约40～160 nm[12]。外泌体可携载生物活性物质，如蛋白质、DNA、mRNA、长链非编码RNA和miRNAs参与细胞间通讯，调节受体细胞的生理病理过程[13]。本研究应用外泌体试剂盒提取M1型小胶质细胞外泌体，透射电镜结果可见其呈圆形或椭圆形，具有双层膜结构，直径范围约为40～160 nm，并且存在外泌体表面标志物CD9、CD63和HSP70的表达，证明已成功提取外泌体。

无论在中枢神经系统生理学中，还是在神经退行性疾病和神经炎症以及神经胶质瘤等脑肿瘤中，外泌体都被认为是神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞之间相互作用的重要调节因子[14]。研究表明，小胶质细胞分泌的细胞外囊泡通过mRNA、miRNA和蛋白在缺血性脑卒中等神经系统疾病的神经功能恢复中发挥重要的调节作用[15]。本研究参照文献[16]并结合预实验结果，加入浓度100 μg/ml的M1小胶质细胞源性外泌体与N2a细胞共培养24 h，结果表明，M组和E组细胞活力和细胞凋亡率无差异，提示外泌体可能是M1小胶质细胞加重神经元损伤的媒介。为了进一步评价外泌体在M1型小胶质细胞诱发神经元损伤中的作用，本研究参照文献[17]选择含有外泌体抑制剂GW4869(10 μmol/L)的细胞培养基孵育M1型小胶质细胞24 h后，收取细胞上清液与N2a细胞共培养。GW4869是目前应用最广泛的阻断外泌体生成的药物之一[18]，其能够抑制神经酰胺介导的多泡小体向内出芽和成熟体释放来自多泡小体的外泌体[17]。本研究结果表明，与M组相比，G+M组细胞活力升高，细胞凋亡率下降；加入GW4869后，可减轻M1型小胶质细胞对神经元的损伤作用，提示M1型小胶质细胞可通过外泌体介导神经元损伤。将值得注意的是，加入外泌体抑制剂只能部分逆转M1型小胶质细胞源性的外泌体介导的神经元损伤，表明M1型小胶质细胞分泌的其他因子也可能会产生神经元损伤作用。

本研究只检测了M1型小胶质细胞源性的外泌体在神经元损伤中的作用，且M1型小胶质细胞源性的外泌体诱发神经元损伤的机制尚需进一步研究。

综上所述，M1型小胶质细胞可通过外泌体介导神经元损伤。

利益冲突

所有作者声明无利益冲突

本文原载于《中华麻醉学杂志》 2022年第6期

免责声明：

文中所涉及药物使用、疾病诊疗等内容仅供医学专业人士参考。

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编辑：Michel.米萱

校对：MiLu.米鹭