ctDNA在局部进展期直肠癌中的研究进展

直肠癌患者在发现时已经发展为局部进展期直肠癌（locally advanced rectal cancer，LARC）。LARC的治疗策略包括新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiotherapy，nCRT）、全直肠系膜切除（total mesorectal excision，TME）和辅助化疗，局部复发和远处转移是导致治疗失败的主要原因。

目前对LARC患者术前辅助治疗疗效和手术切除效果的评估及复发风险的分层缺乏及时有效的检测方法。

基于ctDNA的检测可能实现对LARC治疗反应的无创监测和评估患者的预后。 当前检测技术不仅能检测ctDNA的点突变、短插入和缺失、拷贝数改变、融合基因和表观基因组改变，还可以识别DNA的片段模式。这些生物标志物的检测灵敏度对于LARC的准确评估至关重要。现对ctDNA检测方法及其在LARC中的潜在价值进行概述。

一、ctDNA检测在新辅助放化疗中的应用

1.基线ctDNA检测的意义：Boysen等［5］在75例LARC患者中发现基线cfDNA与病理分期相关，并有助于预测患者的复发。Schou等［6］还发现较高的基线cfDNA水平与较短的无病生存期（disease-free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）显著相关，这种关联在治疗过程中的不同时间点仍然显著。然而Ji等［7］的一项最新研究在不同时间点均没有发现cfDNA水平与生存结果之间的关联，但该研究仅纳入46例患者，并且仅随访了40个月。Appelt等［8］对146例LARC患者进行了127个月的随访，仍未能显示基线cfDNA水平与生存结果之间的关联。

Pazdirek等［9］研究了36例LARC患者发现，与基线ctDNA阴性患者相比，基线ctDNA阳性患者DFS和OS分别减少了1.47年和1.41年。然而Sclafani等［10］对97例LARC患者进行研究并未发现基线ctDNA水平与无进展生存期（PFS）或OS之间存在相关性。在一项纳入85例接受了TNT治疗的LARC患者中仍未发现治疗前ctDNA水平和TNT疗效之间的关系［11］。Tie等［12］等发现nCRT前后的ctDNA水平与病理完全缓解（pathological complete response，pCR）和术后病理结果无关。作者认为基线ctDNA阳性具有诊断意义但其预后价值尚不明确。只有当肿瘤被切除或治疗后，ctDNA的持续阳性提示有微小残留病灶存在和高复发风险。

2. nCRT后ctDNA检测的意义： nCRT后ctDNA阳性患者预后较差，但ctDNA结果与pCR率无关。Tie［12］发表了一项纳入159例接受nCRT+TME的前瞻性多中心研究，发现ctDNA在基线、nCRT后和术后阳性率分别为77.0%、8.3%和12.0%。无论是否接受辅助化疗，nCRT后或手术后ctDNA阳性患者的无复发生存期（RFS）均较差。Khakoo等［13］发现70%nCRT后ctDNA阳性患者和100%术后ctDNA阳性患者出现转移，nCRT后ctDNA检测结果与pCR率无关。然而，Zhou等［14］发现对nCRT疗效好或达到pCR的患者在CRT后ctDNA阳性率较低。TNT后ctDNA阳性与更差的DFS和OS相关。75%（3/4）发生肝转移的患者在TNT后检测ctDNA阳性，而未发生肝转移的患者为9.8%（4/41例）。而在所有仅肺或腹膜复发的患者，TNT后ctDNA均阴性。McDuff等［15］发现nCRT后ctDNA阴性的患者可能获得边缘阴性率、淋巴结阴性切除率和更低的新辅助直肠评分，但患者pCR率升高不显著。在接受标准长疗程nCRT后进行TME治疗的患者中，nCRT后ctDNA与pCR之间无关。Boniface等［16］在TNT治疗后接受等待观察的患者中发现，ctDNA检查较活检证实局部复发提前了10个月。

3. ctDNA动态变化可以评估nCRT疗效： 如果能够从ctDNA的减少和随后的阴性状态中筛选出哪种治疗有效，患者则可以避免其他不必要的治疗。如果辅助治疗不能有效消除ctDNA，那么就需要转向其他替代疗法。Wang等［17］研究发现ctDNA动态变化与LARC患者nCRT疗效相关。相较于未清零患者，治疗中出现ctDNA清零的患者获得pCR率更高。在不同肿瘤消退分级患者中，从pTR G0级到pTR G3级患者的ctDNA清零率显著降低，同时发现从pTR G0级到pTR G3级患者获得性突变检出率呈显著升高趋势。非pCR患者在nCRT治疗后不仅突变清零率低，并且可能出现更多获得性突变，这提示ctDNA动态变化可以预测nCRT疗效。Khakoo等［13］发现ctDNA动态变化联合MRI可以在早期有效评估nCRT的疗效。在CRT中期持续ctDNA阳性或结束时ctDNA阳性与较短的无转移生存期有关。在ctDNA阳性的患者中，在CRT中期分数丰度值>0.07%和CRT结束后分数丰度值>0.13%预测存在转移的敏感性均为100%，预测的特异性在CRT中期和CRT结束后分别为为83.3%和66.7%。CRT后ctDNA检测结果与pCR率无相关性。Zhou等［14］证实在基线、nCRT期间、nCRT后及术后ctDNA阳性与较短的无转移生存期相关。

二、术后ctDNA检测的意义

1. 术后早期ctDNA检测在预测预后和复发中的意义：Khakoo等［13］研究了23例接受nCRT + TME治疗的LARC患者，发现3例术后早期ctDNA阳性患者均出现转移。Tie等［12］在CRT完成后和术后4~10周收集样本。ctDNA在nCRT后和术后血浆样本中分别为8.3%和12.0%。nCRT后或手术后ctDNA阳性患者的RFS均较短，术后ctDNA状态是RFS的独立预测因子。一些研究也证实了术后ctDNA阳性与更差的RFS相关［1，17, 18］。Wang等［17］发现ctDNA检测结合高危病理特征可以对患者的术后复发进行更好的风险分层。Murahashi等［11］发现术后ctDNA和血清CEA联合分析对RFS有累积影响。

2. 术后ctDNA动态变化在监测复发中的意义：目前，LARC患者术后监测手段包括临床检查、连续CT扫描、血清CEA检测等。在临床或放射学证据证明复发之前检测ctDNA的目的是提前发现疾病复发并及时进行治疗。Ⅰ~Ⅲ期结直肠癌患者术后ctDNA状态的变化与患者术后复发风险相关，动态监测ctDNA较术后单次检测提高了预测复发风险能力，连续监测ctDNA阳性预示着复发。与血清学CEA监测相比，ctDNA预测复发时间提前了100 d至8.7月不等［19, 20］。ctDNA检测比放射学预测复发的时间更早。在影像学复发时，ctDNA的敏感性较血清CEA高［21］。但基于LARC患者在等待观察期间或术后随访期间动态检测ctDNA的研究较少。

三、基于ctDNA检测的生物标记物与新辅助放化疗疗效的关系

1. 对nCRT有积极预测意义的生物标记物：在nCRT开始前预测可能的治疗反应很重要。直肠癌中最常见的突变基因包括TP53、APC、KRAS、KMT2B、NOTCH1和POLD1等。POLD1和HRR/HMT信号通路基因突变是nCRT疗效良好的潜在预测因子。基线等位基因突变频率（VAF）和肿瘤突变负荷（TMB）是无转移生存期的一个强有力的独立预测因子。Wang等［17］研究发现POLD1基因在pCR组中的突变频率明显高于非pCR组，且POLD1突变频率从TR G0~3分级呈显著下降趋势。富集分析结果发现，pCR组患者HRR和HMT信号通路基因突变频率显著高于non-pCR组，相关基因突变频率从TR G0到TR G3分级呈显著下降趋势。Zhou等［14］发现POLD1、FAT2和ZFHX3在反应良好组的突变率显著高于反应不良组。POLD1突变型患者的TMB显著增高，基线ctDNA的VAF是无转移生存期的显著独立预测因子。Ji等［7］发现bTMB在基线、nCRT后及手术后均与良好的RFS密切相关。基线高bTMB组患者血清细胞因子IFNγ、IFNα2、IL-1β、IL-2及MIP-1β显著高于低bTMB组，基线高bTMB组患者较好的预后可能与高免疫活性有关。经过nCRT后，bTMB明显降低与较长的中位RFS有关。然而，nCRT后高bTMB水平与RFS呈负相关。bTMB可能改善治疗前后的风险评估并指导LARC的个体化治疗。同样，Murahashi等［11］发现，nCRT反应明显患者的MAF水平较基线显著降低。

高MGMT或ERCC1甲基化水平与LARC患者nCRT后较好的肿瘤消退反应有关。Shalaby等［22］发现MGMT和ERCC1启动子甲基化在直肠癌组织中检出率分别为80%和74%，在血液中检出率分别为58%和60%。MGMT或ERCC1启动子甲基化与临床病理参数之间没有显著相关性，高的MGMT或ERCC1启动子甲基化状态与nCRT后较好的肿瘤消退相关。

2.对nCRT有消极意义的生物标记物：Sclafani等［10］使用ddPCR检测LARC患者的KRAS和BRAF基因突变，发现KRAS和BRAF基因突变不能预测患者的预后，西妥昔单抗治疗疗效与KRAS和BRAF基因突变无关，KRAS和BRAF基因突变不能指导患者对西妥昔单抗的选择。Wang等［17］发现TP53和APC基因突变在非pCR组中高于pCR组，而KRAS基因突变在不同pTRG组间和pCR与非pCR组之间差异均无统计学意义。证实携带有TP53和APC突变的患者是nCRT疗效不佳的预测因素，KRAS突变不能预测nCRT效果。

Chen等［23］发现nCRT前后ctDNA中的低BCAT1或 IKZF1甲基化水平与nCRT后部分或完全pCR有关。其中，1例患者在nCRT术后持续高甲基化基因水平，并且在术后2个月复发。同样，Appelt等［8］发现基线神经肽Y基因甲基化阳性与较差的5年OS密切相关，并且随着基因甲基化负荷增加预后越差。

挑战与展望

目前在LARC中ctDNA检测研究主要在基线、新辅助治疗中、新辅助治疗后及手术后，而对手术后ctDNA的动态监测研究甚少（图1）。基线cfDNA水平可能对预后有一定的价值，但基线ctDNA对预后的效用尚无定论。nCRT或TNT后ctDNA水平与预后有关，nCRT后ctDNA阳性的患者给予强化治疗的收益需要进一步评估。但未发现术前ctDNA结果和pCR率之间的联系，这可能限制单独用术前ctDNA决定是否行保肛手术中的应用。术后早期ctDNA对LARC患者的预后有显著影响，术后ctDNA阳性的LARC患者给予辅助化疗的疗效尚不明确。虽然ctDNA在向临床转化方面已经取得了重大进展，但仍有一些挑战和问题需要解决。

图1：循环肿瘤DNA检测在局部进展期直肠癌中的意义

ctDNA应用于临床前仍需要提高ctDNA检测的敏感性。由于肿瘤组织类型、微小转移灶的解剖位置等因素影响，ctDNA检测仍有一定的假阴性结果。研究表明仅发生腹膜转移、淋巴结转移和肺转移的患者ctDNA阳性比例较发生肝转移的患者更低。Kurtz等［24］近期研发出PhasED-seq检测方法，其检测敏感性明显优于以往检测技术并已在多个实体瘤中得到了证实。未来DNA甲基化和microRNA等生物标志物可能能够克服或补充基于突变的ctDNA检测的敏感性不足。

明确术后最佳采样时间是检测微小残留病灶和辅助治疗决策需要面临的重要问题。手术引起的创伤可以增加cfDNA或野生型DNA释放到血浆中，这掩盖了ctDNA的检测。但是微小残留病灶随时间延长而进展，这意味着最初“肿瘤负荷”很低、ctDNA释放量较小的患者，通过连续采样最终会有足够数量的ctDNA超过检测阈值。检测微小残留病灶的初次抽血的最佳时间可能是在手术后第4周，这不仅避免了术后早期立即抽血进行ctDNA检测引起的干扰，同时在术后第6~8周开始辅助化疗之前可以得到检测结果进而指导治疗。

以往研究通常将ctDNA状态分为可检测（阳性）和不可检测（阴性）。但随着MAF升高，患者复发风险呈指数增长，对于MAF高于0.046%的患者辅助化疗的获益幅度较小，并且给予辅助化疗后仍存在较高的复发风险［25］。因此可以量化ctDNA水平并对预后给予进一步分层并指导治疗。但研究人员也应该寻求标准化ctDNA检测特征和分析变量，以确保检测结果的可重复性。

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引用本文: 黄乾鹏, 张琦, 张师垚, 等. 循环肿瘤DNA在局部进展期直肠癌中的研究进展 [J] . 中华普通外科杂志, 2022, 37(12) : 951-954. DOI: 10.3760/cma.j.cn113855-20220114-00028.

作者：黄乾鹏 张琦 张师垚 肖婉祎 刘刚 天津医科大学总医院普外科