快报 | Xpert MTB/RIF检测在中国西南地区肺外结核中的诊断价值

Evaluation of Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis in Southwest China.

Li TX, Wang J, Yang YS, Wang PS, Zhou G, Liao CY, Zhang HZ, Luo M, Zeng XG, Yang GQ, Yang LJ, Chen YK.

PLoS Negl Trop Dis，17(6):e0011403.

doi: 10.1371/journal.pntd.0011403.

PMID: 37363913.

近日，PLoS Neglected Tropical Diseases杂志发表了重庆市公共卫生医疗救治中心关于评估Xpert MTB/RIF检测方法对肺外结核（EPTB）及疑似患者快速诊断结核病(TB)和检测利福平(RFP)耐药性，以及预测耐多药结核病(MDR-TB)能力的一项回顾性研究（Evaluation of Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis in Southwest China.）。本研究分析了2014年7月23日至2017年3月31日经Xpert MTB/RIF检测的多种类型EPTB患者标本，共计1614例。与分枝杆菌培养和联合参考标准（CRS）相比，Xpert MTB/RIF检测EPTB具有较高的敏感度和特异度。以培养方法或CRS为标准，Xpert MTB/RIF法检测胸腔积液、脑脊液、胸腔引流液和咽拭子标本中MTB的敏感度低于其他标本类型。根据实验结果，该研究认为Xpert MTB/RIF检测是一种快速、简便、敏感度和特异度高的诊断EPTB及检测多种标本耐药的技术，联合表型药物敏感性试验（DST）可能会及时发现更多肺外MDR-TB。重庆市公共卫生医疗救治中心实验室李同心和医学检验科王静为本文的第一作者，重庆市公共卫生医疗救治中心感染科陈耀凯教授为本文的通信作者。

研究背景

Xpert MTB/RIF检测是一种为检测结核病特异性rpoB基因片段而设计的自动化核酸扩增试验，可在2 h内同时检测出利福平耐药性。自2010年以来，Xpert MTB/RIF被世界卫生组织推荐用于肺结核（PTB）的初步诊断，并自2013年起用于EPTB的诊断。与分枝杆菌培养相比，Xpert MTB/RIF是快速 (约2 h) 诊断结核病的更好选择。然而，发现Xpert MTB/RIF在EPTB诊断中的效果在不同类型的EPTB中存在差异。世界卫生组织在检测疑似EPTB患者的非呼吸道标本 (脑脊液、胸腔积液、淋巴结和其他组织) 时，建议采用Xpert MTB/RIF，而不是常规检测 (包括涂片镜检、培养或组织病理学)。然而，这是一个有条件的建议，需要更多的确凿证据。本研究纳入分析的EPTB标本种类和数量较多、范围较广，旨在评估Xpert MTB/RIF在诊断EPTB和检测利福平耐药性中的应用效果，以及联合DST在筛查MDR-TB中的能力。

研究对象

这项研究于2014年7月23日至2017年3月31日在重庆市公共卫生医疗中心进行，纳入患者主要来自重庆市及邻近的四川、贵州和湖北等省份。EPTB标本取自住院患者，除尿液和粪便外，所有标本均由临床医生无菌采集，所有患者血清学检测均为HIV抗体阴性。结核分枝杆菌标准菌株 (H37Rv) 来自中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室。已获得重庆市公共卫生医疗中心伦理委员会许可 (批准号：NO.2019-015-01-KY)。

研究方法

1.实验方法：

所有标本采集、分枝杆菌培养、比例法药物敏感性试验（简称“药敏试验”）均按照中国防痨协会编写的《结核病诊断细菌学检验规程》进行。分枝杆菌培养同时接种MGIT 960培养管和罗氏培养管，任何一种方法阳性即认为培养阳性。比例法药敏试验耐药临界浓度分别为异烟肼 0.2 μg/ml、利福平 40 μg/ml；鉴定培养基药物浓度：对硝基苯甲酸（PNB） 500 μg/ ml、噻吩-2-羧酸肼（TCH） 5 μg/ ml，其商品化试剂盒由珠海市银科医学工程股份有限公司提供。按照制造商说明书 (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) 使用Xpert MTB/RIF对标本进行预处理和测试：活检标本在无菌培养皿中用无菌刀片切成碎块后，加入2:1体积的样品试剂 (SR) 缓冲液；大于2 ml的液体标本，3000 rpm/min离心后倒去上清留取沉淀，在沉淀中加入2:1体积的SR缓冲液；1 ~ 2 ml液体标本直接加入2:1体积的SR缓冲液中；小于1 ml的液体标本加入SR缓冲液使其增加到2 ml。粪便标本预先采用分枝杆菌培养处理程序至接种前的状态，再在沉淀中加入2:1体积的SR缓冲液。Xpert MTB/RIF测试结果由配套软件系统自动解释。

2.统计学处理：

所有数据均输入Excel并使用SPSS 23.0软件进行分析。以培养结果为计算诊断结核病敏感度和特异度的参考标准。比例法DST被认为是利福平耐药的参考标准。本研究的临床诊断参考标准（CRS）包括涂片显微镜检查、培养（液体和固体）、临床表现、组织学/细胞学、特定部位计算机断层扫描/磁共振成像以及自入组之日起3个月后的随访。Kappa系数用于衡量两种方法之间的实际一致性。kappa值＞0.75 被认为是极好的一致性，0.40 ~0.75是较好的一致性，＜0.40是较差的一致性。计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。使用McNemar检验来比较Xpert MTB/RIF和参考标准方法之间的配对数据差异，McNemar值> 0.05表明两种方法差异无统计学意义。

研究结果

一、研究人群的特征

共收集到1614例患者的1614份标本。其中，男性患者占60.9%，女性占39.1%；年龄范围为10 ~ 87岁，年龄中位数为34.9岁，18岁以下115例、18岁及以上1499例。标本包括：胸腔积液475例，脑脊液308例，手术标本233例，淋巴结穿刺液220例，非开放性脓肿92例，伤口分泌物65例，腹腔积液59例，咽拭子52例，其余不同类型标本少于50例。297株培养阳性分离株中，21株为非结核分枝杆菌（NTM）。阴道分泌物、尿液及腹膜引流液等的患者例数较少，均未纳入统计学分析。1614份样本的详细信息见图1。

图1  1614份样本的详细信息

二、以培养法为参照标准评估Xpert MTB/RIF的检测效能

1614份样本中，胸腔积液、脑脊液、手术标本和淋巴结穿刺液等肺外标本较多，分别占29.43%（475/1614）、19.08%（308/1614）、14.44%（233/1614）和13.63%（220/1614）。所有标本均行Xpert MTB/RIF检测，其中21例确定为NTM的患者经Xpert MTB/RIF检测为阴性。Xpert MTB/RIF检测EPTB的阳性率为38.1%（606/1590），而分枝杆菌培养为17.4%（276/1590）。以培养法为参照标准，Xpert MTB/RIF检测的敏感度和特异度分别为80.7%和70.9%。表1显示，Xpert MTB/RIF作为检测非开放性脓肿、下颌下肿块、伤口分泌物、手术标本和淋巴结穿刺液的快速方法具有更高的敏感度和较低的特异度。

表1  Xpert MTB/RIF以培养法为参照标准对不同标本的诊断效能

三、以CRS为参照标准评估Xpert MTB/RIF的检测性能

以CRS为参照标准，Xpert MTB/RIF检测EPTB样本的阳性率为38.1%（605/1590），敏感度和特异度分别为61.7%和98.9%。其中，Xpert MTB/RIF对腹腔积液和下颌下肿块的检测敏感度最高（100%），其次是粪便（91.67%）、伤口分泌物（89.36%）和开放性脓肿（88.24%）；Xpert MTB/RIF检测伤口分泌（85.7%）和手术标本（93.8%）的特异度最低，但检测腹腔积液和下颌下肿块的敏感度和特异度均为100%，且对尿液和开放性脓肿的检测特异度均为100%。这些结果表明，Xpert MTB/RIF作为检测腹腔积液、下颌下肿块、粪便、开放性脓肿、伤口分泌物和尿液的快速检测方法时具有良好的诊断潜力。具体见表2。

表2  以CRS为参照标准Xpert MTB/RIF对不同标本的诊断效能

四、 Xpert MTB/RIF与DST检测利福平的耐药结果比较 

研究分析了222份结核分枝杆菌培养阳性标本的利福平耐药性，见表3。与比例法DST结果相比，Xpert MTB/RIF检测利福平的敏感度和特异度分别为89.5%和97.6%。在检测利福平耐药方面，Xpert MTB/RIF检测胸腔积液、非开放性脓肿、胸腔引流液、开放性脓肿、伤口分泌、手术标本、脑脊液和淋巴结穿刺液的敏感度均较高，但检测伤口分泌（90.0%）和手术标本（95.5%）的特异度最低。总体而言，Xpert MTB/RIF与培养结果高度一致（Kappa = 0.8806，P < 0.001，McNemar= 0.754）。这表明，通过 Xpert MTB/RIF诊断利福平耐药可能是识别EPTB患者利福平耐药性可靠且快速的方法。

表3  Xpert MTB/RIF与DST检测利福平的耐药结果

五、培养阳性样本耐多药性检测结果

为了探索利福平耐药结核病与异烟肼耐药结核病之间的关系，本研究分析了Xpert MTB/RIF检测利福平的耐药结果，以及57份利福平耐药标本表型DST中的异烟肼耐药结果，见表4。在Xpert MTB/RIF检测的51份利福平耐药标本中，有21份耐异烟肼。相比之下，在Xpert MTB/RIF检测的6份利福平阴性样本中，则有4份对异烟肼耐药。在DST检测的57份利福平耐药标本中，25份（43.9%）为耐多药结核病，占222份培养阳性标本的11.3%。这些结果表明，Xpert MTB/RIF联合DST可能会在EPTB中发现更多的耐多药结核病患者。

表4  培养阳性标本中利福平和异烟肼耐药结果

意义与展望

由于缺乏敏感的常规实验室技术，EPTB的诊断仍然是一个挑战。因此，Xpert MTB/RIF检测技术可能在快速准确的诊断中发挥重要作用。在本研究中，Xpert MTB/RIF对诊断EPTB有着较高的特异度，尤其是对于利福平耐药性检测。这对Xpert MTB/RIF或类似测试在EPTB筛查中的潜在用途具有重要意义。与早期的报告类似，本研究发现，以培养法为参照标准，Xpert MTB/RIF诊断EPTB液体标本的敏感度较低，但特异度高，这可能与样本量较少有关，也可能是样本中血液、盐、蛋白质或细胞碎片等抑制剂对PCR扩增酶的干扰，从而抑制PCR反应，造成假阴性结果。

本研究评估了Xpert MTB/RIF检测各种标本的效能，认为Xpert MTB/RIF检测是一种快速、简便、敏感度和特异度高的诊断EPTB及检测多种标本耐药的技术，联合表型DST可能会及时发现更多的耐多药EPTB。然而，对于样本量有限的标本类型（如胸腔引流液和下颌下肿块），无论是通过缩短诊断时间还是提高检测结果阳性率来减少结核病传播都需要进一步研究，而且，Xpert MTB/RIF对于大多数高负担国家来说仍然是一种昂贵的检测技术，需要进一步评估这一发现策略的成本效益。本研究将为未来的计划分析提供更多数据。

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供稿：李同心

编辑：孟    莉

审校：范永德