学术先声丨全面综述总结！基于cfDNA测序进行肺癌早期诊断

本期《学术先声》栏目分享郑州大学第一附属医院赵杰教授研究团队与先声诊断近期合作发表在Expert Review of Molecular Diagnostics（IF=5.1）上的一篇综述[1]，该综述总结了目前基于循环细胞游离DNA （cfDNA）肺癌早筛早诊研究的进展，分析了基于不同cfDNA特征进行肺癌早筛早诊的优缺点，并提出了肺癌早筛早诊临床验证研究设计框架。

本项目受郑州市协同创新重大专项项目“基于高通量测序方法的血浆游离核酸检测关键技术及肺结节和肺癌早筛模型的构建与应用”支持（20XTZX08017）   Research Highlights

1早期发现与诊断对于改善肺癌患者的预后至关重要，液体活检是颇具潜力的早筛早诊技术。

2随着高通量测序技术的进步，循环cfDNA的基因组变异、甲基化和片段组特征被广泛用于进行肺癌早筛早诊研究。

3本文提出一个临床研究设计框架，针对不同目的和阶段的肺癌标志物开发与验证研究。

前言

全球范围内，肺癌的患病率约为220万例/年，死亡人数约为179万例，是最常见的恶性肿瘤，并且是导致与癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）Ⅰ期患者的五年生存率约为80％，而Ⅱ、Ⅲ期患者的五年生存率为13-60％。因此，早期发现对于降低与肺癌相关死亡率至关重要。与传统组织活检方法不同，液体活检通过非侵入性或微创方法采集血液、血清、尿液和其他体液等，获取这些体液中存在的癌症信号（图1）。可能提供癌症信号的物质包括循环游离DNA（cfDNA）、细胞外囊泡（EVs）、miRNA、蛋白质标志物、长链非编码RNA（lncRNA）、循环游离RNA（cfRNAs）、循环肿瘤细胞（CTCs）和肿瘤教化血小板（TEPs）（图1）。其中，cfDNA是最有前景的早期检测生物标志物，因为它包含来自全身组织的遗传和表观遗传信息。

图1. 肺癌早期检测的常规方法和液体活检技术

cfDNA是由于各种原因导致细胞破裂而释放入血液中的高度降解的DNA片段，其长度约为150-200个碱基对，在癌症患者中，cfDNA的半衰期范围从16分钟到2.5小时，因此cfDNA可实时反映肿瘤负担。此外，cfDNA可以非侵入性方式获取，可反复采样监测，免除了组织活检引起的并发症风险。然而，肿瘤细胞来源的DNA与正常细胞来源DNA之间的序列相似性较高，并且大多数cfDNA诊断应用需要来自多个标志物的信息以实现较高的临床敏感性，这使得基于二代测序（NGS）的方法成为cfDNA分析的首选。在本文中，我们总结了基于NGS的cfDNA检测在肺癌早期发现方面的进展。  

cfDNA在肺癌早期发现中的应用

1. 基于cfDNA基因组变异分析的肺癌早筛早诊方法

循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）是来源于肿瘤的血浆DNA，携带具有肿瘤特征的基因组变异，通常仅占总cfDNA的0.1%以下。早期的肿瘤早筛早诊标志物研究主要依赖于检测肿瘤特异性突变，然而基因组变异检测受各种分析前实验条件和虚假信号的影响，此外，cfDNA片段较小，不利于靶向富集，从而增加了将其比对到人类参考基因组的难度，并给复杂位点或突变的检测带来了挑战。科学家已经开发了一系列方法以应对这些挑战，包括独特分子标签（UMI）技术、机器学习等人工智能方法、同时对匹配的肿瘤组织DNA、白血细胞进行测序以帮助对体细胞突变的解释，以及整合多组学技术的集成预测模型构建 （图2A和2B）。其中，应用于肺癌早期检测的典型研究包括TEC-Seq、CAPP-Seq以及CancerSEEK。表1总结了基于cfDNA测序用于肺癌早期检测的不同策略。

图2. cfDNA基因组变异、cfDNA甲基化及cfDNA片段组在肺癌早期检测中的应用

表 1. 基于cfDNA二代测序的肺癌早期检测研究

在图3中展示的研究。

MCDBT-1和MCDBT-2是分别针对平均风险人群和高风险人群开发的，使用了不同的截断值。值得注意的是，这些平台在灵敏度和LoD参数方面并不直接可比，因为它们设计拟应用的适用人群以及适用场景均不完全相同。另一方面，血浆ctDNA分析平台的理论LoD取决于所采集血液样本中是否包含低频突变的DNA分子，以及该突变DNA分子是否被纳入最终的文库并进行测序。此外，不同样本群体间cfDNA浓度的变化直接影响其理论LoD，并且与血浆样本处理、cfDNA提取或cfDNA检测技术的差异也有关。基于基因变异检测的限制在于只能检测已知致癌突变，而许多癌症可能不含已知致癌突变，或者只有少数已知突变且低于随机抽样误差的检测阈值。科学家目前已开发出独立于突变的cfDNA模拟特征，并尝试应用这些模拟特征判断整体信号是否来自肿瘤。基于模拟特征的策略被称为第三代液体活检技术，其中包括表观特征、cfDNA断裂模式以及非肿瘤细胞的基因组和转录组变化等等。

2. 基于cfDNA的甲基化检测用于早期肺癌诊断

DNA甲基化是DNA甲基转移酶介导的将甲基基团添加到胞嘧啶C的第5个碳原子上（5-甲基胞嘧啶，5mC），主要发生在CpG二核苷酸。异常的DNA甲基化促进了肿瘤发生和进展，且由于其甲基化特异性常与组织相关，DNA甲基化分析已成为癌症检测与组织溯源的一种有潜力的方法。目前已开发出各种cfDNA甲基化检测方法，可根据其是否包含亚硫酸盐转化步骤分为两类。其中包含亚硫酸盐转化的方法有全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）、全基因组简化甲基化测序（RRBS）、甲基化CpG串联扩增和测序（MCTA-seq）、靶向亚硫酸盐测序（TBS）、甲基化芯片阵列和甲基化特异PCR（MSP）等 。然而，基于亚硫酸盐转化的方法会破坏DNA且无法区分5mC和5hmC，目前已有一些非亚硫酸盐转化的方法被开发出来，如甲基化cfDNA免疫共沉淀测序（cfMeDIP-seq）。cfDNA甲基化检测的各种方法如图2C所示，关于cfDNA甲基化检测的各种具体方法及其对比可参考Huang等的综述 。

采用基于cfDNA甲基化测序技术进行早期肺癌检测（以及包含肺癌的多癌检测）的典型研究总结于表1中。在https://clinicaltrials.gov网站登记的基于cfDNA检测的代表性临床试验总结在表2中。除肺癌早筛早诊研究外，多癌早筛早诊研究也广泛采用了基于甲基化测序的策略，其中，规模较大、影响较广的如循环细胞游离基因组图谱研究（CCGA）系列研究。cfDNA甲基化检测方法极大地促进了肺癌的早期发现，然而，这些研究也面临着诸如存在年龄驱动的甲基化特征改变等挑战。大约有5%的CpG位点在衰老和肿瘤样本之间存在重叠。与此同时，不同研究使用不同类型数据集以及不同的甲基化panel设计策略，导致试图综合不同研究结果来评价诊断方法的临床性能结果存在挑战。

表 2. 基于cfDNA的肺癌早期诊断临床试验

研究阶段遵循国家卫生研究所（National Institutes of Health）早期检测研究网络（Early Detection Research Network）提出的癌症早期检测生物标志物开发指南，该指南提供了癌症早期检测生物标志物开发的五个阶段。

注：该信息来源于，更新至2023年5月23日。

3. 基于cfDNA片段组学特征检测早期肺癌  

人类cfDNA由不同长度/大小和末端序列的片段组成。使用全基因组测序（WGS）进行的研究发现，肿瘤来源的cfDNA片段的长度比非癌来源的变化程度更高。片段化模式的改变反映了cfDNA释放前染色质结构的变化以及肿瘤发生过程中的其他基因组和表观基因组的改变。cfDNA片段组的各种特征已被用于发现肺癌早期信号（图2D）。

使用片段组特征进行肺癌早期检测的代表性研究列于表1中。此外，Delfi Diagnostics启动了一项名为DELFI-L101的新前瞻性研究（ClinicalTrials.gov：NCT04825834），使用DELFI检测方法来训练和验证肺癌预测模型（表2）。一项仅纳入Ⅰ期肺癌患者的研究利用6个碱基断点基序特征构建逻辑回归模型，实现了96.5%的检测敏感性和93.0%的特异性。不难看出基于表观基因组特征的模型在肺癌早期发现性能上超过了基于突变的模型，尤其是片段组学模型（图3）。当然，在综合评估研究质量时，应全面考虑不同研究的异质性，包括研究设计、目标人群特征及其代表性、肿瘤负荷以及是否整合了其他组学特征等等。

图3. 基于cfDNA测序不同特征的肺癌早期检测研究

4. 肺癌诊断准确性评价的研究设计

评价诊断准确性是早期癌症生物标志物研究的核心目标。研究目的和目标人群应预先定义，筛查的对象为无症状人群，而早期诊断的对象为有癌症相关症状的受试者（如LDCT扫描显示肺结节）。除目标人群不同之外，肺癌的筛查和早期诊断标志物开发和验证遵循类似的路径，但在研究设计类型上两者仍存在差别。

不同的设计类型适用于不同的标志物开发阶段。在探索阶段，通常采用病例-对照设计，该设计的特点是分别对病例组和对照组设置不同的纳排标准（图4A），探索性研究的主要目的是排除那些没有诊断潜力的生物标志物。在肺癌早期诊断的临床验证阶段，目标人群是临床怀疑有肺癌的有症状人群。首先，对所有受试者采集外周血并用待评价方法检测（如cfDNA检测），随后通过病理学评估来确定是否存在肺癌（图4B），另一种设计是调换待评价方法和病理学确认的顺序，两者都属于横断面研究（图4B）。在肺癌筛查的临床验证阶段，目标人群是无症状的，通常为根据肺癌筛查指南定义的高风险个体。筛查研究通常采用如下典型设计，包括嵌套病例-对照设计、前瞻性观察设计和前瞻性干预设计，每种设计类型对生物标志物支持证据的强度由弱到强（图4C）。  

图4. 肺癌早期检测临床验证研究设计框架

结论

尽管cfDNA检测技术发展迅速，但由于肺癌早期来源于肿瘤的cfDNA入血极少，所以检测早期肺癌仍面临巨大挑战。首先，血浆中cfDNA检测的敏感性取决于多种因素，包括可用外周血量、投入DNA分子的数量、肿瘤占比以及检测方法的分析敏感性。其次，在评估各种方法的性能时，应考虑不同人群中癌症的患病率。在相同的敏感性下，不同患病率的癌症会得到截然不同的阳性预测值，而阳性预测值对于高危人群来说更有价值。第三，与致癌突变或染色体异常相比，全基因组甲基化模式和片段组学特征的癌症特异性较低。因此，识别与癌症特异性相关的这些表观模式依赖于大样本集机器学习，而这个过程增加了过拟合以及批次处理效应的风险，尤其是在没有独立验证队列的研究中。因此，如果初步研究显示这些策略具有早筛早诊潜力，则非常有必要在前瞻性独立验证集中进一步验证。最后，需要考虑如何将这些新技术整合到当前的标准诊疗流程（SOC）中。综上所述，cfDNA检测方法的革新和进步为肺癌的早筛早诊提供了令人兴奋的机会，期待这些技术未来能够真正造福早期肺癌患者。

END

参考文献：

[1]  Ruyue Xue, Lu Yang, Meijia Yang, Fangfang Xue, Lifeng Li, Manjiao Liu, Yong Ren, Yu Qi & Jie Zhao (2023) Circulating cell-free DNA sequencing for early detection of lung cancer, Expert Review of Molecular Diagnostics, 23:7, 589-606,  DOI:  10.1080/14737159.2023.2224504

撰写丨 不一样的卡梅拉

编辑、排版丨SX