CAR-iPSC：“均一分化”难题

CAR-iPSC可以诱导生成CAR-T和CAR-NK，是免疫细胞治疗可及性难题的突破口，近两年获得了资本和产业的广泛关注。 均一性是细胞药物需要解决的关键药学问题，也是影响疗效的核心问题。CAR-PSC衍生CAR-T，因为诱导分化的不确定性，让这个问题更加突出。  

CAR-PSC的分化问题

与外周血T细胞制备CAR-T不同，CAR-PSC会因为CAR信号（tonic 或 antigen-induced CAR）扰乱关键的T细胞分化。

2013年纪念斯隆-凯特琳癌症中心Memorial Sloan-Kettering Cancer Center 第一次报道了CAR-PSC诱导生成CAR-T（文献2），但是产生的T细胞为天然免疫表型的γδT细胞。虽然γδT细胞有强的抗肿瘤免疫活性，但是这个研究还是提醒我们，CAR信号会影响PSC的精准分化。 通过调节CAR表达水平、CAR结构、和共刺激单元可以调节CAR信号，是否可以调控CAR-PSC的分化？ CAR信号影响CAR-PSC分化 加州大学洛杉矶分校的研究者使用人工胸腺类器官（artificial thymic organoid，ATO）进行相关研究（文献1）。

CAR  tonic信号诱导ILC2偏向性分化

加入CAR之后，H1胚胎干细胞系的体内分化从成熟T细胞向ILC2偏移。ILC2是一种辅助型ILC谱系，其特征是2型细胞因子反应，包括IL-25、IL-33和胸腺基质淋巴生成素（TSLP）。 

微调CAR信号影响CAR-PSC分化 信号强弱的影响

表达高、中、低三种不同水平CAR，显示ILC2细胞比例逐渐缩小，T细胞比例逐渐升高，提示CAR表达水平高低，影响CAR-PSC向CAR-T的分化。

抗原特异性信号的影响

利用h1-CAR-低PSC系中的弱CAR信号，前瞻性地检验了淋巴细胞发育早期阶段的强CAR信号驱动T细胞向ILC2谱系转移的假设。 模拟基质细胞递呈CD19对H1-CAR-低ATOs的淋巴样发育的影响。构建一个表达CD19的ATO基质系（MS5-hDLL4-CD19），并在EMO（胚胎中胚层类器官）阶段（第14天至第0天）、ATO（人工胸腺类器官）阶段（第0天开始）、或两个阶段用MS5-hDLL4的替代。 结果：仅在EMO阶段插入CD19时，对T细胞发育没有影响。相比之下，在ATO阶段或整个EMO和ATO阶段，CD19的出现导致T细胞分化几乎完全阻断，ILC2生成增加，同时以CD56亚群表达为特征的NK/ILC1谱系细胞显著增加。

CAR结构的影响

CARs的结构元件也影响tonic和抗原依赖的CAR信号，修饰scFv、连接子、铰链、跨膜区和共刺激信号结构域，影响信号强度和下游T细胞功能。 首先，因为CD19 CAR在之前的实验包含一个长，非突变IgG4间隔区，可引起抗原非依赖的Fc受体交联。 因而进一步生成一个使用IgG4“短铰链”（SH）的H1 CAR，包含Fc结合位点的CH2-CH3间隔区被删除。跨膜区使用CD28或者CD8α，包内共刺激结构域使用CD28或者4-1BB。

删除间隔区的CH2和CH3，不影响ILC2偏向性分化。

与CD28信号结构域CAR相比，包含4-1BB信号结构域的CD19 CAR已被证明具有较低的整体信号强度。 CD28 TM结构域本身与增加CAR信号强度有关。 使用4-1BBz CAR PSC系制成的ATO显示出常规CD3 + TCRαβ + CD8SP T细胞分化的完全恢复，几乎没有ILC2或NK / ILC1生成。

这些数据表明（1）CD28 TM结构域本身不足以驱动T细胞到ILC2的转移，（2）尽管比CD28z CAR信号强度弱，但4-1BBz CAR的tonic信号水平足以支持ATO中正常的T细胞发育。

小结

1. Tonic信号驱动T细胞分化为ILC2

2. 淋巴分化早期，CAR激活增强ILC2前体细胞分化

3. 抗原特异性CAR信号激活，增加NK/ILC1的生成

4. 信号强度弱的共刺激信号4-1BB足够支持T细胞分化。

CAR-iPSC向CAR-T 或CAR-NK分化，已经成为现在免疫细胞治疗的重要策略，深入了解CAR信号对PSC分化的影响，有助于产生均一性更强、功能更优的免疫细胞治疗产品。

参考文献 

1. Li et al., Strength of CAR signaling determines T cell versus ILC differentiation from pluripotent stem cells，Cell Reports 42, 112241, March 28, 2023

2. Themeli, M., Kloss, C.C., Ciriello, G., Fedorov, V.D., Perna, F., Gonen, M., and Sadelain, M. (2013). Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nat. Biotechnol. 31, 928–933

3. Ueda, T., Shiina, S., Iriguchi, S., Terakura, S., Kawai, Y., Kabai, R., Sakamoto, S., Watanabe, A., Ohara, K., Wang, B., et al. (2022). Optimization of the proliferation and persistency of CAR T cells derived from human induced pluripotent stem cells. Nat. Biomed. Eng. 7, 24–37

来源：闲谈 Immunology 2023-03-30