科研丨Gut Microbes: 嗜黏蛋白阿克曼氏菌降低高脂饮食小鼠对单核细胞增生李斯特菌感染的易感性

编译：微科盟听雪斋

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   

高脂肪(HF)饮食可降低对食源性病原体单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的抗性。本研究证明，在喂食HF饮食的小鼠中，短期灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)可以增加对口服和全身单核细胞增生李斯特菌感染的抗性。嗜黏蛋白阿克曼氏菌减少了感染前喂食高脂肪饮食的小鼠肠道和肝脏的炎症，并将回肠的炎症细胞浸润减少到与喂食低脂肪(LF)饮食的小鼠相似的水平。阿克曼氏菌给药对微生物群和微生物代谢产物的影响很小，不影响单个分类群，也不影响拟杆菌门与厚壁菌门的比例。综上所述，嗜黏蛋白阿克曼氏菌通过其与宿主肠道之间的特异性相互作用调节免疫/生理作用，从而增强了喂食HF饮食的小鼠对单核细胞增生李斯特菌感染的抗性。    

论文ID

原名：Akkermansia muciniphila reduces susceptibility to Listeria monocytogenes infection in mice fed a high-fat diet

译名：嗜黏蛋白阿克曼氏菌降低高脂饮食小鼠对单核细胞增生李斯特菌感染的易感性

期刊：Gut Microbes

IF：12.2

发表时间：2023.7

通讯作者：Cormac G. M. Gahan

通讯作者单位：爱尔兰科克大学

DOI号：10.1080/19490976.2023.2229948    

实验设计

结果

1、嗜黏蛋白阿克曼氏菌增强高脂饮食小鼠对单核细胞增生李斯特菌感染的抗性 

作者先前的一项研究发现，喂食HF饮食的小鼠对李斯特菌感染的易感性更高。当前的研究旨在分析小鼠在李斯特菌感染前(第13天采样)和李斯特菌感染期间(第16天采样)发生的事件(图1a)。 

与之前的研究类似，在灌胃(IG)病原体后，与LF小鼠相比，HF饮食显著增加了肝脏和肠系膜淋巴结的感染负荷。然而，在喂食HF饮食+灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌的小鼠中没有观察到这种增加(Akkermansia+HF(AHF)组)(图1b)。当研究饮食和嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理对系统性李斯特菌感染的影响时，与LF小鼠相比，HF小鼠的脾脏、肝脏和肠系膜淋巴结中的细菌负荷显著增加，而AHF组也没有出现这种增加(图1c)。总体而言，数据表明，嗜黏蛋白阿克曼氏菌在功能上提高了喂食HF饮食的小鼠对单核细胞增生李斯特菌感染的抵抗力。

图1. 高脂肪饮食增加了对口腔和全身单核细胞增生李斯特菌感染的易感性，但在用嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理的小鼠中没有这种增加。

研究时间线(a)。一组小鼠全程喂食低脂肪(LF)或高脂肪(HF)饮食，而另一组小鼠喂食高脂肪饮食，同时灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌(AHF，每组n = 30只小鼠)。每组10只小鼠于第13天处死，以检查感染前的生理环境，而其余小鼠在第16天处死前通过灌胃(IG)或腹腔注射(IP)感染李斯特菌。高脂肪饮食增加了IG感染小鼠肠系膜淋巴结和肝脏中的李斯特菌菌落形成单位(CFUs)，而在喂食高脂饮食和灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌的小鼠中没有出现这增加现象。在IP注射感染的小鼠中，高脂肪饮食增加了小鼠肠系膜淋巴结、脾脏和肝脏中的李斯特菌CFUs，而在喂食高脂肪饮食和灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌的小鼠中也没有出现这种增加现象。    

2、在喂食高脂饮食的小鼠中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌减少回肠炎症和杯状细胞的产生，但提高了肝脏免疫基因的表达 

在本研究模型中，为了研究嗜黏蛋白阿克曼氏菌增强对单核细胞增生李斯特菌感染抵抗力的可能机制，重点研究了在第13天，即感染前一段时间出现的明显变化。通过qPCR在远端回肠和肝脏中测量了饮食导致的宿主基因表达变化，无论有无嗜黏蛋白阿克曼氏菌(图2a)。与LF相比，喂食HF饮食的小鼠回肠中免疫基因Tnfα、Foxp3和Ccl2的表达显著增加，与先前的研究一致，并且在喂食嗜黏蛋白阿克曼氏菌的HF小鼠中没有这种增加(图2a)。此外，与AHF相比，HF小鼠回肠中Il1β的表达增加，而与LF相比，HF中Reg3γ的表达增加(图2a)。 

H&E染色回肠切片的组织学分析显示，HF饮食增加了以多核细胞和单核细胞为特征的回肠炎症(如前所述)。然而，在用嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理的小鼠中没有观察到这种浸润(图2b，d)。这表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌干预可以缓解短期HF饮食小鼠小肠的炎症，这与提高对感染的抵抗力相一致。组织学分析还显示，HF饮食组的杯状细胞数量增加，而AHF组再次没有出现这种情况(图2c)。 

与肠道中的研究结果相反，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增强了喂食HF饮食的小鼠肝脏中饮食诱导的Tnfα和Reg3γ基因的表达(图2a)。与LF相比，AHF小鼠的Il1β表达显著降低，而HF小鼠的Tnfα和Reg3γ相对于LF升高，AHF小鼠的Tnfα和Reg3γ相对于HF饮食小鼠均增加(图2a)。这表明高脂肪饮食诱导的基因表达在回肠中受到抑制，但在肝脏中加剧。

  图2. 嗜黏蛋白阿克曼氏菌减少回肠炎症表达和杯状细胞数量，同时加剧肝脏免疫表达。

通过qPCR检测回肠远端和肝脏中炎症基因的表达。结果显示，在第13天，嗜黏蛋白阿克曼氏菌抑制了回肠中的炎症表达，但加剧了肝脏中的炎症(a，ANOVA和KW检验，然后分别进行Tukey或FDR成对比较，每个纯色矩形代表一只小鼠)。这一点在回肠中得到了组织学分析的证实(b)，该分析还揭示了高脂肪饮食诱导的回肠杯状细胞数量的增加，而在用嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理的小鼠中同样没有出现这种增加(c)。H&E染色回肠的代表性图像(d)。箭头突出显示绒毛顶部(黑色箭头)和隐窝底部(蓝色箭头)存在多形核细胞。第16天的qPCR分析显示，高脂肪饮食抑制了炎症信号传导，而嗜黏蛋白阿克曼氏菌增加了Ccl2的表达，也显著增加了肝脏中Tnfα的表达(e，ANOVA和KW检验，然后分别进行Tukey或FDR成对比较，每个纯色矩形代表一只小鼠)。   

3、在单核细胞增生李斯特菌感染的情况下，高脂肪饮食抑制回肠免疫信号传导，而嗜黏蛋白阿克曼氏菌增加Ccl2的表达 

先前有报道称，喂食HF饮食的小鼠在感染单核细胞增生李斯特菌的情况下免疫信号受到抑制，这可能为这些小鼠对感染的易感性增加提供了一种机制。在本研究中，我们同样观察到与李斯特菌感染后的LF相比，HF组回肠中Il1β和Ccl2的表达降低。有趣的是，暴露于嗜黏蛋白阿克曼氏菌使HF组中Ccl2的表达增加到与LF组相似的水平(图2e)。   

4、在短期HF饮食喂养期间，嗜黏蛋白阿克曼氏菌不会显著改变肠道菌群 

肠道微生物群在管腔病原体和肠上皮之间提供屏障，并调节肠道免疫反应；介导对外源病原体的定植抗性的作用。本实验研究了嗜黏蛋白阿克曼氏菌对单核细胞增生李斯特菌感染的保护作用是否可以通过对微生物群群落结构的更广泛影响来介导。第13天，各组之间的α多样性没有显著差异(图3a)，而第13天各饮食组间的β多样性均有显著差异(图3b)。 

在第13天，饲喂HF饮食(无论有无嗜黏蛋白阿克曼氏菌)的小鼠拟杆菌门的丰度降低，而AHF小鼠的厚壁菌门相对于LF增加(图3c)。这些变化通常与HF饮食、轻度炎症和屏障功能降低有关。本研究的数据表明，在喂食HF饮食的小鼠中，给药嗜黏蛋白阿克曼氏菌并没有显著改变拟杆菌门或厚壁菌门的水平。 

接下来，作者比较了第13天每种饮食中最丰富的200个分类群，并确定了Alistipes、Aceatifactor、拟杆菌属(Bacteroides)、Muribaculum、Parastuteralla和几个未确定分类群的丰度存在显著差异(图3d)。对于大多数分类群，其在LF小鼠中的丰度与HF和AHF小鼠显著不同，而高脂肪饮食之间没有差异，这表明这些变化是由饮食(而非嗜黏蛋白阿克曼氏菌给药)驱动的。以Bacteroides-0004和Muribaculum-0115为例，AHF组的丰度显著低于LF组。然而，HF组和AHF组之间不存在显著差异，这表明阿克曼氏菌并不通过微生物群组成的整体变化来影响对李斯特菌的抗性。 

微生物组分析表明，虽然单核细胞增生李斯特菌感染降低了总细菌多样性，但在第16天，不同处理之间的α多样性没有显著差异(图3a)，β多样性显示各组之间没有分离(图3b)。

在感染期间，不同处理间拟杆菌门和厚壁菌门的丰度没有差异(图3c)。HF饮食通常与厚壁菌门增加和拟杆菌门减少有关，正如在第13天观察到的那样，这表明菌门的一致性可能反映了李斯特菌感染的均质效应。类似地，在属水平上，经多重比较校正后，第16天没有显著差异(数据未显示，ANOVA和KW检验，然后分别进行Tukey或FDR成对比较，p > 0.05)。总体而言，本研究确定了嗜黏蛋白阿克曼氏菌在感染处理组(AHF)之前对微生物群落的影响很小，与单独喂食HF饮食组相似。在感染期间，本研究证明了所有小鼠组的一致性，反映了感染对微生物群群落结构的潜在主导影响。

  图3. 嗜黏蛋白阿克曼氏菌的保护作用似乎不是由肠道微生物群的变化驱动的。

肠道微生物组通过16S基因测序进行分析。虽然α多样性随着时间的推移而下降，但在任何一个时间点，组间没有变化(a，ANOVA和KW检验，然后分别进行Tukey或FDR成对比较)。在第13天，各组之间的β多样性差异显著，但这种差异在第16天消失(b，Bray-Curtis相异性的PERMANOVA)。与低脂饮食组(LF)相比，高脂肪饮食组和高脂肪饮食+嗜黏蛋白阿克曼氏菌组(AHF)的拟杆菌门相对丰度在第13天都有所下降，而在第13天AHF组厚壁菌门相对丰度与LF相比有所增加，但这些差异在第16天消失(c，ANOVA和KW检验，然后分别进行Tukey或FDR成对比较)。在第13天，各组之间有几个分类群存在显著差异(d，ANOVA和KW检验，然后分别进行Tukey或FDR成对比较)，这些变化似乎是由饮食(而非嗜黏蛋白阿克曼氏菌)驱动的，而在第16天没有显著差异的分类群。   

5、粪便和盲肠代谢产物的变化主要由饮食引起

为了研究李斯特菌感染前后HF饮食和嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理引起的微生物代谢产物的变化，作者在第13天每组随机选择6只小鼠，对盲肠内容物中的短链脂肪酸进行了靶向分析，并对粪便中的半极性代谢产物进行了非靶向分析。主成分分析(PCA)发现各组在盲肠或粪便中没有差异(图4a，b)。盲肠中的SCFA之间没有检测到显著差异(补充图1)。在粪便中，在HF和AHF小鼠之间没有检测到变化(图4c)，这表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌的保护作用不是通过这些代谢物介导的。

图4. 在第13天，嗜黏蛋白阿克曼氏菌的保护作用似乎不是由粪便或盲肠代谢组驱动的。

第13天，采用UPLC测定各组盲肠中的短链脂肪酸和粪便中的半极性代谢产物来检测微生物代谢物的产生。主成分分析未检测到各组之间盲肠或粪便代谢物的变化(a和b，主成分分析)。仅列出了显著差异代谢物，这些代谢物至少鉴定到基于在同一系统上分析的标准品获得的准确质量和已知保留时间的水平(c，ANOVA和KW检验，然后分别进行Tukey或FDR成对比较)。    

讨论

西方化的饮食包括高热量的脂肪摄入和低可发酵纤维的摄入，这与炎症性肠病、肥胖症和2型糖尿病等疾病有关。西化饮食也会损害肠道屏障功能，并广泛影响免疫信号传导。事实上，作者团队最近的研究表明，在相对较短的时间内(2周)，喂食高脂肪(HF)饮食的小鼠对单核细胞增生李斯特菌引起的胃肠道和全身感染的易感性增加。本研究证明了短期HF饮食对肠道组织学和炎症状态的显著改变，这与微生物群的可预测变化(厚壁菌门增加和疣微菌门减少)同时发生。然而，尚不清楚对宿主免疫的影响是由饮食还是微生物群介导，或者微生物群的特定成分是否可以在适当的情况下提供抗感染保护。鉴于嗜黏蛋白阿克曼氏菌受到HF饮食的负面影响，并与对宿主屏障功能的积极影响有关，本文研究了嗜黏蛋白阿克曼氏菌在HF饮食背景下对宿主感染易感性的作用。 

在代谢性疾病、糖尿病和肥胖模型中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌一直与积极的健康益处相关。人类肠道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌的水平与体重呈负相关，而小鼠补充嗜黏蛋白阿克曼氏菌可以逆转HF饮食诱导的体重增加、高脂血症、炎症和肠道通透性。在本研究的短期(肥胖前)模型中，HF饮食增加了炎症标志物的表达，但通过灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌可显著减少炎症。先前的研究已经证明，在反映肥胖或2型糖尿病发展的长期饮食模型中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌的干预具有广泛的抗炎作用。本研究的数据表明，即使在较短的时间内(肥胖前)，这种作用也可以证明，并且与对单核细胞增生李斯特菌感染的抗性提高有关。 

与在回肠中观察到的炎症标志物的抑制相反，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增强了肝脏中的炎症基因表达。与LF小鼠相比，HF小鼠肝脏中Tnfα和Reg3γ的表达水平更高，并且在AHF小鼠中进一步增加。这是一个出乎意料的发现，可能反映了本研究的短期性质，因为据报道，嗜黏蛋白阿克曼氏菌可以降低肝损伤小鼠模型中的TNFα，并在艰难梭菌感染模型中减少炎症。在本研究的感染模型中，肝脏中Tnfα表达的升高可能会增强对病原体的系统抗性。事实上，值得注意的是，在李斯特菌感染期间(第16天)，当观察到李斯特菌载量减少时，这些高水平的表达得以维持(图1c)。通常，在感染期间(第16天)，喂食HF饮食的小鼠和喂食HF饮食+嗜黏蛋白阿克曼氏菌的小鼠回肠中的宿主反应相似。这涉及在李斯特菌感染期间，喂食高脂肪饮食的小鼠免疫信号传导的抑制，这在以前的报道中可能有助于对感染的易感性。一个例外是，与HF组相比，喂食HF饮食+阿克曼氏菌的小鼠中Ccl2的表达增加。CCL2介导的单核细胞CCR2趋化因子受体的刺激在对李斯特菌感染的先天免疫反应中起着至关重要的作用，表明先天免疫的调节可能有助于阿克曼氏菌诱导对该病原体的抗性。 

在本研究模型中，为了确定嗜黏蛋白阿克曼氏菌给药是否影响微生物群群落结构，使用16S扩增子测序分析了李斯特菌感染前和感染期间的肠道微生物群。分析表明，HF饮食增加了厚壁菌门，减少了拟杆菌门，这在我们之前的短期喂养研究和许多长期小鼠肥胖研究中都有提到。然而，在本研究模型中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌给药两周内没有改变厚壁菌或拟杆菌门的特征。同样，虽然长期给药嗜黏蛋白阿克曼氏菌的研究报告了对肠道微生物群中特定细菌相互作用的影响，但未能确定嗜黏蛋白阿克曼氏菌对单个分类群的显著影响。作者认为，在HF饮食背景下，嗜黏蛋白阿克曼氏菌对微生物群群落结构的更大影响可能是时间依赖性的。令人惊讶的是，LF组和HF组之间检测到的阿克曼氏菌丰度没有显著差异，但高脂肪饮食仍增加了感染负荷。这表明，HF饮食增加对李斯特菌感染易感性的机制不仅仅涉及抑制嗜黏蛋白阿克曼氏菌，尽管当前研究中概述了灌胃该物种提供的保护作用。 

此外，对细菌代谢产物的广泛分析表明，与单独喂食HF饮食的小鼠相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌给药并没有显著改变代谢组。总的来说，这些结果表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌对宿主免疫和抗李斯特菌功能的影响与肠道微生物群群落结构的更广泛变化无关，并且可能是嗜黏蛋白阿克曼氏菌与宿主胃肠道相互作用的直接结果。几项研究已经检测了这种相互作用的分子效应，这种相互作用是通过嗜黏蛋白阿克曼氏菌蛋白AMUC_1100和P9介导的。事实上，研究表明，与活细菌培养物相比，巴氏灭菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌或纯化的AMUC_100可以对宿主产生类似的作用。未来将研究巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌或蛋白质提取物发挥抗感染作用的潜力。 

据我们所知，这是首次报道嗜黏蛋白阿克曼氏菌给药对食源性感染性病原体的影响。本研究结果表明，嗜黏蛋白阿克曼氏菌和宿主肠道之间的特定相互作用可以调节局部炎症特征和胃肠道环境，但不依赖于更广泛的微生物群落结构的改变。这些发现建立在先前的工作基础上，这些工作已经确定了有助于对单核细胞增生李斯特菌感染的定植抗性的特定分类群，从而促进了预防或减少食源性感染的微生物干预措施的发展。