ChIP揭示NRF1促进原始生殖细胞的发育、增殖和存活

原始生殖细胞（Primordial germ cell，PGC）是生殖细胞前体，可以产生卵母细胞和精子，确保生命延续。尽管PGC特化（PGC specification）得到广泛研究，但PGC种群在出生前迁移到胚胎性腺后如何维持和扩大仍然难以捉摸。转录因子（如PRDM1/BLIMP1、PRDM14和TFAP2C）和信号分子（如BMP和WNT）在PGC特化中发挥着至关重要的作用。核呼吸因子1（Nuclear respiratory factor 1，NRF1）是一种已知参与线粒体生物发生的转录因子。最近研究表明，在精子发生过程中，NRF1与生殖细胞特异性基因CpG富集的低甲基化启动子区结合，并直接激活其转录。目前研究揭示与周围的体细胞相比，胚胎期迁移后的PGC中NRF1高表达，可能是由于PGC基因组逐渐低甲基化。此外，NRF1是PGC体外和体内增殖和存活所必需的，且当异位表达时，NRF1积极促进PSC分化。

2023年8月4日，华东师范大学生命科学学院研究生王鹏翔等为第一作者在《Cell Proliferation》杂志发表题为“NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival”的研究论文，该研究以原始生殖细胞（PGC）为研究对象，通过RNA-seq和ChIP-seq等实验表明NRF1通过调控支持PGC编程的广泛转录网络和线粒体代谢，参与调控迁移后PGC存活和增殖。本研究为PGC发育背后的功能机制提供了新的线索，并验证NRF1是此过程中以前未被鉴定的调控因子。

标题：NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival（NRF1促进原始生殖细胞的发育、增殖和存活）

时间：2023-08-04

期刊：Cell Proliferation

影响因子：IF 8.5

技术平台：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等

研究摘要：

NRF1是一种已知的线粒体代谢调控因子，在PGC迁移后发育中起着关键作用。本研究结果表明，在胚胎发育过程中，NRF1蛋白水平在PGC迁移后逐渐升高。胚胎生殖细胞的特异性Nrf1敲除导致PGC增殖和存活受损。此外，NRF1还可以主动促进多能干细胞的PGC分化。通过全转录组分析和ChIP-seq分析进一步发现NRF1直接调控PGC形成中的关键信号分子、增殖和细胞周期中的转录因子以及线粒体代谢中的酶。总的来说，本研究结果强调了NRF1调控广泛转录网络以支持体外和体内迁移后PGC发育。

研究结果

（1）生殖细胞中特异性Nrf1敲除破坏迁移后PGC发育

图1：NRF1为原始生殖细胞（PGC）发育所必需。

（A）用NRF1和OCT4抗体在E9.5小鼠胚胎上通过免疫组织荧光（IHF）检测PGCs中NRF1表达。

（B）用NRF1抗体和生殖细胞特异性蛋白DDX4抗体对E11.5–15.5胚胎性腺进行IHF测定。（A-B）比例尺：50 μm。插入显示了代表性区域放大图像。

（C-D） 通过PGCs中的Tnap-Cre对野生型对照胚胎和Nrf1特异性敲除胚胎（Nrf1−/f-Cre）的E11.5–13.5性腺进行IHF测定，抗Nrf1和OCT4抗体（C），抗Nrf1和DDX4抗体（D），用细胞核染料DAPI复染。比例尺：15 μm。

（C）白色箭头表示NRF1表达完全消失的OCT4+ PGC。

（2）PGCs中Nrf1缺失导致雄性和雌性小鼠不孕

图2：Nrf1基因敲除导致雄性和雌性小鼠不孕。

（A）Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠在P0和7周龄的睾丸形态。

（B）Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠在8周龄时睾丸和附睾的组织学研究。

（C）Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠7周龄的卵巢形态比较。

（D）Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠7周龄的卵巢切片组织学研究。黑色箭头和数字表示卵泡的不同发育时期。1：原代卵泡；2：次生卵泡；3：黄体。

（3）NRF1缺失破坏了迁移后PGCs的存活和增殖

图3：NRF1是迁移后原始生殖细胞（PGCs）增殖和存活所必需的。

（A）用p20-GFP或p20-Cre-p2a-GFP诱导分化的Nrf1f/f PSC的流式细胞术分析。通过SSEA1染色检测GFP+PGC样细胞（PGCLCs），右侧显示GFP+/SSEA1+PGCLC百分比。

（B）使用BV421标记的抗Ki67抗体通过流式细胞术分析（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC。

（C）将（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC与BV421标记的膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）共染色，然后通过流式细胞术分析样品。（A–C）数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。***：p<0.001.

（D-E）E11.5时Nrf1−/f-Cre胚胎及其野生型同窝同伴小鼠生殖嵴上的免疫组织荧光（IHF），使用抗OCT4和Ki67的抗体（D），或OCT4和裂解的Caspase 3（CASP3）抗体（E）。白色箭头表示Nrf1−/f-Cre胚胎中的OCT4+/Ki67非增殖PGCs（D）或OCT4+/Caspase3+凋亡PGCs（E）。比例尺：10 μm。

（4）NRF1过表达促进PSC PGCLC形成

图4：NRF1促进PSC形成PGC样细胞（PGCLC）。

（A）通过real-time RT-PCR检测BV+PGCLC中Nrf1和原始生殖细胞（PGC）标记基因的相对mRNA水平，与从BVSC PSC分化的BV−体细胞进行比较。

（B）与对照组（Ctrl）相比，内源性Nrf1激活（Nrf1a）时通过流式细胞术检测BV+PGCLC。

（C）内源性Nrf1激活后，通过real-time RT-PCR检测第6天EB的相对mRNA水平。（A–C）数据以两次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。

（D）BVSC PSCs分化第5天的流式细胞术分析。在PSC分化的第2-5天，通过DOX处理诱导NRF1表达（p20-NRF1）。使用相同DOX处理的空载体作为对照（p20）。左图为流式细胞术的代表性结果，中间panel为BV+PGCLC百分比。右图为BVSC PSC分化第5天EB的代表性图像。

（E）real-time RT-PCR检测第5天分化的EBs中Nrf1和PGC标记基因的mRNA水平。在PSC分化的第2-5天，通过DOX处理诱导NRF1表达。（D–F）数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。（A-F）*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。N.S.：无显著性。

（5）NRF1是直接调控PGC形成、线粒体代谢和细胞增殖的关键基因

图5：NRF1调控转录网络，诱导PSCs分化为PGC样细胞（PGCLC）

（A）RNA-seq分析中差异表达基因的Venn图，Log2倍数变化>0.58，p<0.05。

（B）有或无NRF1过表达（OE）的BV+PGCLC的RNA-seq分析检测到的基因火山图。

（C）有或无NRF1-OE的BV+PGCLC差异表达基因的GO分析（Log2倍数变化>0.58，p<0.05）。

（D）对DOX诱导的NRF1-OE（p20-NRF1）或空载体对照（p20）的BV+PGCLC的real-time RT-PCR分析。数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。*: p < 0.05;**: p < 0.01。***: p < 0.001。

图6：原始生殖细胞（PGCs）NRF1介导的转录网络特征。

（A）从BV+PGC样细胞（PGCLCs）中进行的ChIP-seq分析中获得的NRF1结合motif。

（B）从ChIP-seq分析中获得的基因组区域NRF1结合位点分布。

（C）BV+PGCLC中NRF1结合的靶基因的GO分析。

（D）ChIP-seq分析的基因组区域中NRF1靶基因启动子区域的代表性peaks。

（E）用NRF1抗体或IgG对照对BV+PGCLC的免疫沉淀的基因组DNA进行实时PCR分析。数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。

参考文献：

Wang P, Su J, Wang J, Xie Y, Chen W, Zhong J, Wang Y. NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival. Cell Prolif. 2023 Aug 4:e13533.