科研丨南农: 桔梗多糖通过靶向肠道菌群减轻高脂饮食引起的小鼠肥胖(国人佳作)

编译：微科盟皮皮，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读   桔梗(Platycodon grandiflorus，PG)富含可溶性多糖，因其抗炎和抗肥胖作用在亚洲传统饮食和草药中有着悠久的历史。作者之前的研究首次建立了PG的有益作用与肠道微生物群变化之间的联系，并提出了多糖成分发挥的潜在作用。然而，需要更多的证据来了解PG(PS)多糖的抗肥胖功能及其与肠道微生物群调节的关系。本研究首先探索了PS的抗肥胖活性：雄性C57BL/6小鼠(6周龄)分别饲喂标准对照饮食(CON)或高脂饮食(HFD)以诱导肥胖，或HFD中添加PS(HFPS)，持续8周。全程监测体重和食物摄入量。通过RNA-seq分析脂肪组织中脂质代谢和相关基因的表达变化。利用细菌16S rRNA基因测序来探索粪便样本中的肠道微生物群结构。然后，进行了第二个实验以探索PS的抗肥胖活性是否依赖于肠道微生物群的调节：雄性C57BL/6小鼠(6周龄)，用抗生素混合物处理以减少肠道微生物负荷，饲喂HFD(A-HFD)或HFPS(A-HFPS)饮食8周。最后，通过体外发酵实验来验证PS对肠道微生物生长和代谢活性的影响。本研究发现，PS显著降低了HFD引起的体重增加和过度脂肪积累，改变了参与脂质代谢的关键基因的表达，并减弱了HFD引起的肠道微生物群的变化。然而，PS不影响肠道微生物群耗尽小鼠的脂肪积累或脂质代谢。综上所述，本研究结果表明，PS对小鼠模型中的肠道菌群有显著影响，其抗肥胖作用是通过改变肠道菌群组成和代谢活性来介导的。  

图文摘要    

论文ID

原名：Polysaccharides fromPlatycodon grandiflorus attenuates high-fat diet induced obesity in mice through targeting gut microbiota

译名：桔梗多糖通过靶向肠道菌群减轻高脂饮食引起的小鼠肥胖

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：7.5

发表时间：2023.8

通讯作者：杨丹晨

通讯作者单位：南京农业大学动物医学院

DOI号：   10.1016/j.biopha.2023.115318    

实验设计

结果

1. PS降低了HFD喂养小鼠的体重、脂肪积累并改善血脂异常

在8周研究结束时，HFD小鼠的体重显著高于CON小鼠，从第3周开始观察到这种差异(图1B，C)。相反，在整个实验过程中，HFPS组和CON组小鼠的体重没有统计学差异。值得注意的是，与HFD小鼠相比，HFPS组小鼠的体重增加较慢(直线斜率较小)，但两组之间的能量摄入没有差异(图1B、C、E)。上述观察结果表明，PS对体重的影响与饮食习惯的不良影响无关。8周后，三组小鼠的总体重增加出现显著差异(图1D)。此外，白色脂肪组织(WAT)中的脂肪积累也存在差异，HFPS组小鼠的WAT质量和脂肪细胞大小均小于HFD组小鼠(图2B)。附睾脂肪细胞和肝组织的组织学分析显示，与HFD小鼠相比，HFPS小鼠的脂肪组织肥大和肝脏脂肪变性较少(图2A-E)。此外，与HFD小鼠相比，HFPS小鼠的血浆TC、TG、HDL、LDL水平和LDL/HDL比值降低(表1)，表明肥胖风险降低。

图1. PS降低了HFD小鼠的体重。(A)第一个动物实验设计。(B)体重(n = 9)。(C)干预17周后体重增加预测值(n = 9)。(D)干预8周后体重增加预测值(n = 9)。(E)每笼小鼠的平均每日能量摄入(n = 3)。标记不同字母表示差异显著，P < 0.05。CON，标准对照饮食；HFD，标准高脂肪饮食；HFPS，补充HFD+PS；PS，桔梗多糖。

表1. CON、HFD、HFPS组小鼠血清生化分析。

图2. PS可减少HFD小鼠脂肪组织和肝脏中脂肪细胞的增生和脂肪堆积。(A) H&E染色评估附睾WAT形态(比例尺：50 µm) (n = 9)。(B)白色脂肪组织质量(附睾、腹股沟和肾周白色脂肪组织)(n = 9)。(C)平均附睾脂肪细胞大小(n = 9)。通过(C) H&E染色和(E)油红O染色确定的肝脏组织学(比例尺：100 µm) (n = 9)。标记不同字母表示差异显著，P < 0.05。CON，标准对照饮食；HFD，标准高脂肪饮食；HFPS，补充HFD+PS；PS，桔梗多糖；H&E，苏木精-伊红染色。

2. PS调节eWAT中脂质代谢基因的表达

对eWAT进行RNA测序，以检测不同饮食处理之间基因的差异表达，这可能导致HFPS小鼠的脂肪堆积减少。总共测序了79,147,248,564个碱基对，经过质量过滤后定位到11,773个基因。不同组小鼠的转录谱存在差异，主成分分析(PCA)确定了基于处理的聚类(CON、HFD、HFPS)(图3A)，表明所有小鼠都表现出饮食特异性转录反应。CON组与HFD组的比较显示，共有828个基因差异表达(log2FC≥|1|，p值<0.05)，而HFPS和HFD组之间差异表达基因较少(n = 717，图3B，C)。当映射到京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路数据库时，这些基因在一系列代谢信号通路中表现出富集，特别是与脂肪酸代谢和脂质代谢相关的通路(图3D)。值得注意的是，在HFPS小鼠中，PPAR信号通路是最显著富集的信号通路(图3D)。在PPAR信号通路中富集的29个基因主要参与脂质代谢；包括脂质降解(Rxrg、Pparg、Cd36、Acbp、Lpl、Fabp1、Fabp2、Acsl3、Acsl4、Slc27a1、Slc27b2、Slc27a4)、脂质生物合成(Me1、Scd1)、脂质储存(Plin2、Plin4、Plin5)、脂质转运(Pltp、Apoa2、Apoa5)、β-氧化(Cpt1a、Cpt2、Acadm、Acaa1b、Acox1、Ehhad)和胆固醇代谢(Hmgcs2、Cyp7a1、Cyp8b1)(图4A)。这与实时定量PCR的结果一致，其中PPAR信号通路中脂质代谢的几个关键基因受到饮食的调节，尤其是PPARg上调最为显著(图4B)。综上所述，这些结果表明，PS影响脂质代谢相关基因的表达，PPAR信号通路的激活可能有助于PS对肥胖发展的影响。

  图3. PS调节eWAT中脂质代谢基因的表达。(A) eWAT转录组的PCA显示样本间多样性和聚类(n = 3)。火山图显示(B) CON组与HFD组、(C) HFD组与HFPS组之间的差异表达基因(log2FC≥|1|，p＜0.05)(n = 3)。(D) KEGG通路富集分析变化最显著的途径(n = 3)。点的大小表示信号通路中差异表达基因的数量。eWAT，附睾白色脂肪组织；PCA，主成分分析；KEGG，京都基因与基因组百科全书。

图4. PS影响eWAT中PPAR信号通路。(A)三种饮食处理间PPAR信号通路中差异表达基因的热图。倍数变化>   1和p<   0.05的基因被认为是差异表达基因(n   =   3)。(B) PPAR信号通路中差异表达基因的实时qPCR分析(n   =   9)。

3. PS可预防HFD引起的小鼠肠道生态失调

先前的研究表明，饮食和肠道微生物群之间的相互作用是肥胖和糖尿病表型发展的重要调节因子。因此，本研究通过对CON、HFD和HFPS组小鼠粪便样本中细菌16S rRNA基因(V3-V4区)扩增测序，研究了PS对肠道微生物群组成的影响。共测序442,923,850个碱基对，经过质量过滤和嵌合体检查后产生1,066,901个reads。以97%同源性聚类，总共产生449个OTUs。各处理组之间共享的OTU和各处理组特有的OTU的具体数量见补充图1。稀疏曲线和Pan分析显示，样品之间的曲线相似，末端趋于平坦，表明所有样品的测序深度相当且足够(补充图2)。

肥胖的一个重要特征是肠道微生物群的多样性降低。肠道微生物群的Shannon指数增加和Simpson指数降低均证实，与CON相比，HFD显著降低了肠道微生物群多样性(图5A、B)。而HFPS组的这两个指数与CON相比没有显著差异，但Simpson指数在HFPS组和HFD组之间没有显著差异(仅在Shannon指数中观察到显著差异)(图5A、B)。此外，HFPS小鼠的Shannoneven指数降低(与HFD小鼠相比)表明α多样性评估的均匀度，尽管它与CON组仍有显著差异(图5C)。总体而言，与HFD小鼠相比，HFPS小鼠肠道微生物群的α多样性增加。主坐标分析(PCoA)显示了三组小鼠肠道细菌组成的总体差异(图5D，E)。这些差异可以通过属水平上细菌组成的相对丰度进一步可视化(补充图3)。

图5. PS改变了HFD小鼠肠道微生物群的多样性。通过(A) Shannon指数、(B) Simpson指数和(C) Shannoneven指数估算样本α-多样性(n = 6)。样本间多样性(β-多样性)由OTU水平丰度下(C)非加权和(D)加权Unifrac距离的PCoA表示 (n = 6)。PS，桔梗多糖；PCoA，主坐标分析；OTU，操作分类单元。 

从科到OTU水平的分类群的LEfSe分析结果发现，不同处理组之间的主要贡献者(LDA得分>3.5)存在差异(图6A、B)。结果发现，尽管不同饮食组的优势OTU数量和类型不同，但毛螺菌科(Lachnospiraceae)在所有样本的肠道微生物群中都占优势(图6B)。HFD诱导的群落由9个来自毛螺菌科的OTU主导(相对丰度>45%)，拟杆菌属(Bacteroides)和来自Oscillospiraceae的4个OTU具有中等优势(图6B)。CON群落的优势度较低，Muribaculaceae和Faecalibaculum显著增加，Bacteroides和毛螺菌科减少(图6B)。HFPS群落主要由毛螺菌科的其他4个OTUs主导(相对丰度>35%)。总体而言，HFD和CON小鼠之间微生物组成的差异主要是由于HFD中Muribaculaceae和Faecalibaculum的优势降低以及毛螺菌科、Oscillospiraceae和Dubosiella的增加引起的(图6B)。值得注意的是，与HFD和CON小鼠相比，HFPS小鼠的阿克曼氏菌属(Akkermansia)比例明显更高(图6B)。

Akkermansia、Faecalibaculum和Muribaculaceae的许多成员以其产生SCFAs的能力而闻名，因此，本研究分析了小鼠粪便中的四种主要SCFAs，结果发现与HFD小鼠相比，HFPS小鼠粪便中的乙酸、丙酸和丁酸浓度显著增加(图7)。

图6. PS改变了HFD小鼠的肠道微生物群组成。(A)通过对从科到OTU水平的分类群进行LEfSe分析，找出各处理组间差异的主要贡献菌(LDA得分> 3.5)(n = 6)。(B) LDA得分> 3.5，并且根据相对丰度通过Kruskal-Wallis H检验计算，在三种饮食处理中存在显著差异的微生物(n = 6)。*P < 0.05，***P < 0.01，***P < 0.001。PS，桔梗多糖；LDA，线性判别分析；OTU，操作分类单元。

图7. PS增加了HFD小鼠肠道中SCFAs的产生。盲肠内容物中(A)乙酸、(B)丙酸、(C)丁酸和(D)戊酸的浓度(n = 9)。标记不同字母表示差异显著，P < 0.05。CON，标准对照饮食；HFD，标准高脂肪饮食；HFPS，补充HFD+PS；PS，桔梗多糖。

4. PS对HFD小鼠的有益作用取决于肠道菌群

为了进一步研究PS改善HFD引起的肥胖是否取决于肠道微生物群，我们在实验2中使用广谱抗生素消除了肠道微生物群(图8A)。与实验1中的小鼠相比，抗生素处理的小鼠粪便中提取的DNA量减少了约100倍(补充表3)，表明肠道微生物群显著减少。测量了几个变量，包括体重(图8B)、体重增加(图8C)、平均能量摄入(图8D)、细胞大小(图9A、E)、白色脂肪组织的重量(图9D)和肝组织中的脂肪积累(图9B、C)，在这些肠道微生物群耗尽的HFD小鼠中，无论是否喂食PS(A-HFPS或A-HFD)，都没有显示出显著差异。此外，与A-HFD小鼠相比，A-HFPS小鼠的血浆TC、TG、HDL和LDL水平没有显著差异(表2)。这些结果表明，PS在饮食诱导的肥胖中的作用依赖于肠道微生物群的作用。

图8. PS对体重的降低取决于肠道微生物群的存在。(A)第二个动物实验设计。(B)体重(n   =   9)。(C)干预8周后体重增加(n   =   9)。(D)每笼小鼠的平均每日能量摄入(n   =   3)。A-HFD，HFD+添加抗生素混合物的无菌饮用水；A-HFPS，HFPS+添加抗生素混合物的无菌饮用水；PS，桔梗多糖。

图9. PS减少脂肪积累取决于肠道微生物群的存在。(A)通过H&E染色评估附睾白色脂肪组织形态(比例尺：50   µm)(n   =   9)。通过(B) H&E染色和(C)油红O染色确定的肝脏组织学(比例尺：100   µm)(n   =   9)。(C)白色脂肪组织质量(附睾、腹股沟和肾周白色脂肪组织)(n   =   9)。(D)平均附睾脂肪细胞大小(n   =   9)。 表2. A-HFD和A-HFPS小鼠血清生化分析。

5. PS在体外促进肠道细菌生长和SCFAs的产生

在上述体内模型中，我们发现与HFD和CON小鼠相比，HFPS小鼠的肠道微生物群中Akkermansia的丰度更高。此外，我们还进行了厌氧发酵实验，以探讨PS对体外肠道细菌(特别是Akkermansia)生长和代谢活性的影响。两组(Bac vs. PS+Bac)的总细菌和Akkermansia的生长曲线显示出相似的模式(图10A和B)，而PS促进了肠道细菌的增殖。24 h时，PS+Bac组的Akkermansia平均数量(107.7)约为Bac组(106.73)的10倍(图10B)。此外，我们还研究了PS对体外厌氧发酵过程中肠道菌群产生SCFAs的影响，结果如图10C、D、E所示。总体而言，随着PS厌氧发酵时间的延长，乙酸、丙酸和丁酸的浓度均有所增加。在不添加PS的发酵体系中，细菌也能够产生低浓度的SCFAs，而添加PS显著提高了这三种SCFAs的产量。

图10. PS在体外促进肠道细菌的生长和SCFAs的产生。不同时间体外培养体系中(A)总细菌数量和(B) Akkermansia数量。(C)乙酸、(D)丙酸、(E)丁酸在体外培养体系中不同时间的浓度(n = 3)。Bac，在BHI培养基中培养的粪便菌悬液；PS+Bac，在添加桔梗多糖的BHI培养基中培养的粪便菌悬液。

讨论

PG是一种丰富的多糖来源，与大多数常见蔬菜相比，其浓度更高。作者之前的研究描述了PG中PS对肥胖的有益影响，这归因于肠道微生物群的变化。先前的体内研究主要集中在PG中的皂苷成分，而忽略了PS的作用。一些体外研究表明PS具有增强免疫和抗氧化的特性，但其在体内的作用尚未得到证实。 本研究发现，PS有效缓解了HFD引起的小鼠体重增加、脂肪和肝组织中的过度脂肪堆积以及高脂血症。此外，本研究发现PS可以抑制HFD诱导的肠道微生物群的组成、结构和代谢功能的变化，特别是增加SCFAs的产生。本研究的微生物群耗竭小鼠模型结果进一步支持了PS对肥胖的影响取决于肠道微生物群功能的假设。由于抗生素对宿主能量代谢的影响，以及对饮食引起的肥胖(尤其是高剂量暴露)产生耐药性的可能性，人们对抗生素诱导的微生物群耗竭动物模型的有效性表示担忧。然而，在本研究中，我们使用了低剂量的长期抗生素暴露，并观察到A-HFD和A-HFPS小鼠的脂肪积累比对照组更多。因此，本研究中A-HFD和A-HFPS小鼠的体重相似不太可能是抗生素处理或肠道微生物群缺乏导致脂肪代谢减弱的结果。

综上所述，本研究的结果表明，PS对饮食引起的肥胖的作用取决于肠道微生物群的作用。总体而言，本研究结果强调了PS在对抗饮食引起的肥胖中的有益作用，以及肠道微生物群发挥的关键作用。 PS对肠道微生物组成的主要影响是Muribaculaceae、Faecalibaculum和Akkermansia的丰度显著增加。Muribaculaceae以前被称为S24-7，是拟杆菌目中的一个细菌科。这一发现与作者之前的研究一致，即PG显著增加了HFD肠道群落中Faecalibaculum和S24-7中几个OTU的比例。Muribaculaceae最近被确定为一种主要的粘液-单糖觅食者，与依赖粘液来源营养物质的病原体竞争，使其成为健康肠道的生态守门人。 本研究发现，PS在体内和体外都能促进Akkermansia的生长，并增加SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸)的产生。Akkermansia于2004年首次在人类粪便中发现，与粘液健康有关，并被发现具有益生元功能，包括减轻HFD引起的肥胖和代谢紊乱，改善结肠炎，增强肠道免疫和肠道屏障，并具有抗癌和抗衰老的作用。Akkermansia定植于肠粘液层，是一种典型的肠粘膜常驻细菌。它降解肠道粘液产生乙酸和丁酸，同时促进粘液分泌和粘膜免疫，从而增强肠道屏障。肥胖引起的肠道菌群失衡通常伴随着肠道屏障功能障碍，肠道通透性增加，导致全身性炎症和代谢紊乱加剧。本研究发现Akkermansia、Muribaculaceae和SCFAs(由细菌产生)增加，因此进一步研究PG对肠粘液层和肠道屏障功能的影响将是有用的。 饮食性肥胖涉及与多种信号通路相关的基因表达的改变。本研究对处理组之间转录组差异的综合分析表明，PS对许多与肥胖相关的基因都有影响，特别是在PPAR信号通路中。PPAR是脂肪酸水平及其衍生物变化的传感器，可以改变基因转录以响应配体结合。这使其成为维持生理稳态的关键因素，包括脂质和碳水化合物代谢，因此是解决代谢紊乱的重要靶点。 本研究发现，PS减少了HFPS小鼠的脂肪和肝脏脂肪积累，并降低了血浆TC、TG、HDL和LDL水平，这与PPAR信号通路中基因的变化一致。此外，PPAR信号通路中的一些基因也受到AMPK的调节，如Pparg、Cd36、Lpl、Scd1和Cpt1，这在一定程度上解释了先前的发现，即PG或其提取物可以改变AMPK信号通路中基因的表达。 PPAR信号通路和肠道微生物群之间的相互作用已被广泛研究，发现一些细菌可以调节PPAR信号通路并减轻HFD引起的小鼠肥胖。产丁酸微生物也被证明会影响PPAR-γ信号传导，并将结肠上皮细胞的能量代谢转向β-氧化。本研究发现，PS增加了几种产生SCFAs的肠道细菌的比例，并提高了粪便中乙酸、丙酸和丁酸的浓度，这可能解释了PPAR信号通路的变化。然而，还需要进一步的研究来验证这种关系。 综上所述，本研究的结果表明，PS有可能通过改变HFD引起的肠道微生物群组成和功能的变化来减轻HFD诱导的肥胖。本实验为进一步研究PS有益作用的潜在机制奠定了基础，并强调了PS作为功能性食品的潜力。未来的实验需要充分了解PS诱导的肥胖相关表型变化与肠道微生物群之间的因果关系，以及PS中的哪些化合物调节肠道微生物群。