I期临床：NY-ESO-1 TCR-T治疗晚期软组织肉瘤患者

NY-ESO-1特异性TCR-T细胞对表达NY-ESO-1抗原的肿瘤有效，但安全有效的TCR-T细胞治疗方案仍有待改进。在这里，报告了一项靶向NY-ESO-1的亲和力增强的特异性TCR-T细胞疗法（TAEST16001）的新药I期临床试验。入组患者在经低剂量的环磷酰胺（15mg/kg/d×3d）联合氟达拉滨（20mg/m2/d×3d）清除淋巴细胞后接受TAEST16001细胞输注，回输后给予小剂量IL-2注射维持体内TCR-T细胞。12例接受上述方案治疗的患者没有出现治疗相关的严重不良反应。客观缓解率（ORR）为41.7%，中位无进展生存期(PFS)为7.2个月，中位缓解持续时间(DOR)为13.1个月。TAEST16001细胞治疗为晚期软组织肉瘤患者提供了一种安全有效的治疗方案(ClinicalTrials.gov: NCT04318964)。

软组织肉瘤(STS)是一组由50多种不同组织学类型组成的异质性间叶癌。约60%的软组织肉瘤患者在确诊时存在局部病变，40%的患者在5年内发生转移。晚期、不可切除或转移性STS的治疗方案在数量和疗效上都很少见。作为单药治疗或与异环磷酰胺联合使用的蒽环类药物是最传统的一线治疗方案。在蒽环类药物方案进展后，二线治疗方案包括达卡巴嗪、异环磷酰胺、吉西他滨、多西他赛、曲贝替定、艾日布林或帕唑帕尼。然而，这些药物的生存益处通常并不令人满意，因为它们的ORR低(5%-16%)，疾病控制持续时间短，以及与治疗相关的副作用的风险。因此，迫切需要对晚期STS患者进行更有效和更耐受的治疗，而免疫疗法可能提供有吸引力的解决方案。

NY-ESO-1被认为是肉瘤免疫治疗的潜在靶点，免疫组化染色显示NY-ESO-1在88%的粘液样脂肪肉瘤、49%的滑膜肉瘤和35%的粘液纤维肉瘤中表达。尽管先前的几项研究表明，过继转移的靶向NY-ESO-1的TCR-T在NY-ESO-1+滑膜肉瘤中初步有效。TCR-T细胞治疗的一些重要问题，如最佳亲和力、细胞剂量、预测生物标志物和最小毒性的共识仍有待探索。

T细胞的有效治疗需要T细胞的浸润。T细胞浸润可以通过在CDR的突变来产生高亲和力的TCR来优化TCR-pHLA界面来改善。使用以前发表的方法，通过噬菌体展示增强了TCR的亲和力，该TCR是从健康捐赠者的PBMC中分离出来的，用于开发针对HLA-A∗02:01 NY-ESO-1 157-165的TCR-T细胞(TAEST16001)。临床前研究表明，TAEST16001细胞具有良好的安全性和有效性。在这里报告了新药临床试验的结果，该试验评估了低剂量IL-2维持的TAEST16001细胞用于治疗晚期软组织肉瘤的安全性、耐受性、药代动力学、药效学和初步疗效。还研究了反应和选定的预先指定的生物标记物之间的相关性。

TAEST16001细胞的制造

开发了在GMP条件下使用封闭式和半封闭式模块化系统生产TCR-T细胞的制造程序(图S1A)。为了验证该过程，使用来自三个健康捐赠者的PMBC制备了TAEST16001细胞。最终产物显示出主要的记忆表型(图S1B)和介导的INF-γ的释放和对NY-ESO-1+肿瘤细胞系或T2细胞的特异性裂解(图S1C-G)。在这项临床研究中，所有患者都采用了该制造工艺。

图S1 TAEST16001细胞GMP级生产的表型和功能特征。(A)TAEST16001细胞制造方案。临床站点在24小时内收集患者的分离产品并将其运往制造站点。去除CD14和CD25阳性细胞，用αCD3/αCD28 beads激活并转导慢病毒载体编码的TAEST16001 TCR基因（详细见下图）。细胞扩增9-14天，然后收获、清洗和冷冻以进行释放测试。(B)T细胞亚群组成。用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。Tn(幼稚，CD45RO-CCR7+)，Tcm(中央记忆，CD45RO+CCR7+)，Tem(效应记忆，CD45RO+CCR7-)，Tte(终末分化效应，CD45RO-CCR7-)。TAEST16001细胞与肿瘤细胞共培养后的INF-γ释放(C)和细胞毒(D)测定。A375、IM9和U266B1均为HLA-A*0201和NY-ESO-1阳性。H1650为HLA-A*0201阳性，NY-ESO-1阴性。T2+(T2细胞负载NY-ESO-1 157-165肽)，T2-(T2细胞负载无关多肽)。INF-γ释放采用ELISpot法，细胞毒采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法，效靶比E:T=5:1。(E)用NY-ESO-1 Tetramer或无关Tetramer染色，流式细胞仪检测TAEST16001细胞的表达。(F)TAEST16001细胞与肿瘤细胞共培养后释放INF-γ。表达无关TCR的T细胞作为阴性对照。(G)TAEST16001 TCR或无关TCR(阴性对照)转导的T细胞与肿瘤细胞共培养24 h，用LDH释放法检测其对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。A375(HLA-A2+，NY-ESO-1+)，NCI-H1703(HLA-A2+，NY-ESO-1+)，NCI-H1299(HLA-A2-，NY-ESO-1+)，SW480(HLA-A2+，NY-ESO-1-)。

患者和治疗特征

在2020-3-23至2021-12-31期间，对436例肉瘤患者进行了HLA-A∗02:01和NY-ESO-1的筛查。共纳入12例NY-ESO-1+晚期、无法切除的HLA-A*02:01+患者(图S2)。在入选的12名患者中，10名患者患有滑膜肉瘤，2名患者患有脂肪肉瘤(1例粘液样脂肪肉瘤，1例去分化脂肪肉瘤)。中位年龄33岁(25-67岁)，男性占58.3%(7/12)。83.3%的患者至少接受过2次化疗。从入组到TAEST16001细胞输注的中位时间为43天(IQR，35.5-46.5天)。所有12名患者都接受了改良淋巴细胞清除，其预适应剂量比先前报道的要低(表S1)，然后是中位数3.24×10^9个TAEST16001细胞(范围0.51-11.96×10^9)加上低剂量的全身IL-2(每次500,000 IU，每天2次，持续14天)。患者和接受TCR-T细胞的特征分别见表1和表S2。

图S2 患者筛查。

表S1 不同NY-ESO-1特异性TCR-T细胞临床试验的疗效和不良反应比较

表1 患者基本特征

表S2 输注TCR-T细胞的特征

TAEST16001细胞的安全性和耐受性

在剂量递增阶段，在TAEST16001细胞输注后28天内没有观察到预定义的剂量限制毒性(DLT)。在12名受试者中，最常见的3级或更高级别的不良反应是淋巴细胞减少(100%)、中性粒细胞减少(92%)、白细胞减少(83%)和贫血(33%)，这些主要归因于淋巴耗竭的前提条件(表2)。其他相关的3-4级毒性包括发热(8%)、血小板减少(8%)、低钾血症(8%)、丙氨酸氨基转移酶升高(8%)、蛋白尿(8%)和高甘油三酯血症(8%)。2名处于第二细胞剂量水平的患者出现了2级CRS，并在细胞输注后第二天出现发热。2例患者分别于第3天和第4天出现低血压和低氧。1名患者接受了tocilizumab治疗，另1名患者接受了氧疗，两人都在一周内从CRS中恢复，没有并发症。所有患者均未发生神经毒性或细胞输注相关的严重不良反应。

TAEST16001细胞的药效

接受规定细胞剂量TAEST16001的所有12名患者都符合疗效分析，9名(75%)患者肿瘤消退(图1A)。在该试验中，输注TAEST16001细胞的患者的中位反应时间(TTR)为1.9个月(范围为0.9-3个月)，中位反应持续时间为13.1个月(范围为5-14.3个月；图1B)。6名患者(50%)在第一次放射学评估后肿瘤负担持续降低(图1C)。在初次分析时，12例患者中有5例部分缓解，ORR为41.7%(图1A，表S3)。5例(41.7%)病情稳定，疾病控制率83.3%。5例无肺转移的患者中有4例(80%)有部分缓解。中位PFS为7.2个月(图1D)。在数据截止时(2022年4月15日)，10名患者有疾病进展，其中一人已死于疾病。因此，当时被审查的比例为11/12(91.7%)，中位数OS是不成熟的。

图1接受TAEST16001细胞治疗的12名患者的临床反应和无进展生存结果

表S3 临床反应

值得注意的是，患者T06(42岁，男性)，曾接受过二线治疗，在接受TAEST16001治疗后经历了2级CRS，在细胞输注4周后上臂和多处肺转移灶出现部分反应，并在治疗后维持了14个月以上(图2A)。由于肺转移灶即使在进展时仍有很大的部分反应，患者接受了上臂病变的手术切除。另一位患者T02(27岁，男性)，在接受5次手术后右腿复发粘液样脂肪肉瘤，也表现出部分反应，并在治疗后持续1年以上(图2B)。

图2显示肿瘤消退的CT

TAEST16001细胞的扩增和持久性

所有12名患者都接受了药代动力学评估。输注前后指定时间点μg基因组DNA(gDNA)的TCR基因拷贝数如图3A所示。细胞输注后中位Cmax为52582拷贝/μg gDNA(11156-838655)，Tmax中位数为6天(0.08-20)。Cmax值在四个剂量组之间没有显著差异(图3B)。与无应答组(中位，25160拷贝/μg gDNA；11156-447847；图3C)相比，有应答者(中位，103806拷贝/μg gDNA；26260-838655)TCR-T细胞有增加的趋势。在持续监测超过25周的5名患者中检测到循环中表达TCR-T细胞(图3A)。

图3 TCR-T细胞扩增峰值及其与应答的关系

TAEST16001细胞表型随时间的演变

在制造产品和输注后对TAEST16001细胞的记忆细胞表型进行评估。评估了以下四个T细胞亚群，即幼稚T细胞(Tn)、中央记忆T细胞(Tcm)、效应记忆T细胞(Tem)和终末分化效应T细胞(Tte)，发现Tn在所生产的四个T细胞亚群中所占比例最低(图4A)。在过继转移后，观察到循环Tetramer+CD3+TCR-T细胞中Tcm和Tem亚群的频率增加(图4A和4B)。在细胞输注后第180-270d，Tcm和Tem亚群频率的增加更为明显(图4A)。还分析了生产产品中T细胞亚群的频率与细胞输注后每μg gDNA中TCR基因拷贝数峰值的相关性。结果表明，CD45RO+CCR7-(Tem)细胞的频率与与每μg gDNA的TCR基因拷贝呈正相关(图4C)。

图4 TAEST16001细胞输注后的表型演变及其与每μg gDNA TCR基因拷贝的相关性

外周血生物标志物与免疫应答的相关性

细胞输注后检测IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)、铁蛋白(ferritin)等多种炎性细胞因子及外周血T细胞表型。IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、SAA、CRP和ferritin峰值的中位(范围)时间分别为2(1-19)、3(2-6)、3(2-9)、3(1-7)、5(3-20)、4.5(3-6)和6(3-9)天。IL-2、IL-6、IL-10、SAA、ferritin峰值与疗效无显著相关性。然而，应答者的IFN-γ和CRP峰值显著高于无应答者(图5)。细胞输注后第28天CXCR3+CD3+T细胞或CXCR3+CD3+CD8+T细胞的百分比与患者的反应呈显著正相关。其他T细胞亚群，如CD3+CD4+、CD3+CD8+、Tn、Tcm、Tem、Tte、CD3+CD25+Foxp3+(调节性T细胞)、CD3+CXCR6+、CD3+PD1+、CD3+LAG3+、CD3+TIM3+、CD3+CTLA4+、CD3+CD8+CXCR6+、CD3+CD8+PD1+、CD3+CD8+LAG3+、CD3+CD8+TIM3+和CD3+CD8+CTLA4+与患者反应无关(图S4)。

图5 炎性细胞因子峰值与肿瘤反应的关系

图S4 在预定时间检测外周血中T细胞亚群与肿瘤反应的关系

总结

在目前的I期临床研究中，评估了TAEST16001细胞在表达NY-ESO-1抗原的晚期软组织肉瘤患者中的安全性和临床活性。通过这项严格的剂量递增研究，进一步证明了TAEST16001细胞治疗的耐受性良好，没有与细胞输注相关的严重不良事件，也没有与治疗相关的死亡或不良事件。结果表明，可以选择本研究中的最大递增剂量作为II期研究的剂量确认，它往往与TCR-T细胞在体内的扩增水平相关，并且具有与低水平剂量相似的安全性。总的来说，这些数据提供了证据，证明TAEST16001细胞治疗与改良淋巴清除和低剂量IL-2一起使用是安全的。TAEST16001细胞的反应令人印象深刻，包括1.9个月的中位TTR和41.7%的ORR，表明TAEST16001细胞具有高效的抗肿瘤活性。中位PFS为7.2个月，未达到中位OS。正如以前的研究所观察到的，对TCR-T细胞治疗并不是所有的患者都有反应。外周血中TCR-T细胞的低扩增峰、HLA的下调，以及抗原呈递机制的缺陷，可能是导致对TCR-T细胞疗法的主要抵抗的原因。患者抵抗TCR-T细胞治疗的一个可能原因可能与高亲和力TCR-T细胞过度激活后T细胞衰竭有关，因为耗竭的T细胞表现出抗肿瘤功能的进行性丧失和抑制性受体的表达上调。需要进一步的研究才能更好地了解对TCR-T细胞获得性抵抗的潜在机制。结果没有显示TCR-T细胞的峰值扩增与肿瘤反应之间的正相关，这可能是由于样本量小，II期研究中有必要进行进一步的研究。

应答者的CRP和IFN-γ水平高于无应答者，进一步证实了TAEST16001细胞的临床疗效。它们的增加表明T细胞的激活。IFN-γ一直被认为是激活细胞免疫和刺激抗肿瘤反应的关键作用。有趣的是，应答组中CXCR3+CD3+或CXCR3+CD3+CD8+T细胞的百分比在统计上显著增加，因为IFN-γ是诱导T细胞上CXCR3的一个重要因素。这些结果表明，外周血中更多的CXCR3+CD8+T细胞意味着更多的T细胞转运到肿瘤微环境，并表现出更强的抗肿瘤免疫反应，但由于缺乏可用的肿瘤样本，这一结果不能在本研究中进行评估。

这里研究有几个局限性。首先，主要的限制是样本量小，因此需要进一步研究体内TCR-T细胞扩增峰值与细胞输注剂量之间的关系。其次，与TCR-T细胞治疗反应相关的生物标志物还没有得到全面的了解，还需要更多的临床验证。

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