尿路上皮癌FGFR抑制剂耐药机制及克服策略，迄今最大研究！

几种用于治疗成纤维细胞生长因子受体（FGFR）驱动突变的尿路上皮癌的FGFR抑制剂已获批或正处于临床开发中，而导致患者复发的分子耐药机制尚未得到充分探索。识别了21例接受选择性FGFR抑制剂治疗的FGFR驱动突变的尿路上皮癌患者，分析了进展后组织和/或循环肿瘤DNA（ctDNA）。7例（33%）患者检出单个FGFR酪氨酸激酶结构域突变（FGFR3 N540K，V553L/M，V555L/M，E587Q；FGFR2 L551F），1例（5%）患者检出多个突变（FGFR3 N540K，V555L和L608V）。使用Ba/F3细胞，探索了这些突变对多种选择性FGFR抑制剂的耐药/敏感性。11例患者（52%）携带PI3K-mTOR通路基因变异（n = 4 TSC1/2，n = 4 PIK3CA，n = 1 TSC1和PIK3CA，n = 1 NF2，n = 1 PTEN）。在患者衍生模型中，存在PIK3CA E545K时，厄达替尼与pictilisib具有协同作用，而厄达替尼联合吉非替尼能够克服EGFR激活介导的旁路耐药。本研究在尿路上皮癌中发现了高频FGFR激酶结构域突变导致FGFR抑制剂耐药，是迄今为止这方面最大的研究。脱靶耐药机制主要涉及PI3K-mTOR通路。本研究提供了临床前证据支持联合治疗策略来克服旁路耐药。

研究背景

成纤维细胞生长因子受体（FGFR）基因家族分子变异是尿路上皮癌的常见事件。FGFR3突变是低级别非肌层浸润性膀胱癌的标志，在高级别肌层浸润性肿瘤中的发生率为12%-22%。上尿路尿路上皮癌占尿路上皮癌的不到10%，高达60%的高级别病例携带FGFR3突变。FGFR3激活突变主要发生在FGFR3细胞外结构域（S249C，R248C和Y373C热点）。致癌FGFR3融合（TACC3为最常见的伴侣基因）见于高达2%至3%的膀胱癌，在上尿路尿路上皮癌中也可见。其他FGFR基因激活变异虽然罕见，在尿路上皮肿瘤中也有报道。

尿路上皮癌中，FGFR致癌激活变异为选择性FGFR抑制剂靶向治疗干预提供了机会。在导致FDA批准厄达替尼（erdafitinib）的II期试验中，101例FGFR3突变或FGFR2/3重排患者接受厄达替尼治疗，起始剂量每天8mg，客观缓解率（ORR）和中位无进展生存期（PFS）分别为40%和5.5个月。另外两种可逆抑制剂，英菲格拉替尼（infigratinib）和佩米替尼（pemigatinib），以及不可逆抑制剂futibatinib，在FGFR选择的尿路上皮癌患者中疗效略差，但futibatinib数据主要来自既往接受过FGFR抑制剂治疗的患者。最近，一项II期试验显示，可逆抑制剂rogaratinib用于治疗选择的FGFR1/3 mRNA过表达的经治患者，并未优于化疗。在21例随机分配接受rogaratinib治疗的FGFR3突变或融合患者中，11例获得缓解（ORR 52.4%）；在15例接受化疗的FGFR3变异患者中，4例获得缓解（ORR 26.7%）。

与其他癌基因驱动突变的疾病一样，原发性和获得性耐药限制了FGFR抑制剂在尿路上皮癌中的疗效。关于FGFR抑制剂耐药机制的证据仅限于一项研究分析了22个英菲格拉替尼治疗进展后的循环肿瘤DNA（ctDNA）样本。在4例患者中发现获得性FGFR3酪氨酸激酶结构域突变（FGFR3 V555L，V555M和L608V，根据NM_000142.4转录本）。

本文为FGFR驱动突变的尿路上皮癌患者选择性FGFR抑制剂耐药的分子和功能研究。FGFR酪氨酸激酶结构域突变和脱靶分子激活较常见。根据记录的耐药机制，使用临床前模型评估了其他方案（其他FGFR抑制剂）和联合治疗策略，为未来临床应用提供了潜在指导。

研究结果

晚期/转移性尿路上皮癌的分子图谱

收集了56例晚期/转移性尿路上皮癌患者的临床和分子数据（n = 39膀胱，n = 15上尿路，n = 2两种位置均有）。38例患者对组织活检样本同时进行了全外显子组测序（WES）和RNA测序（RNA-seq），9例仅进行WES，1例仅进行RNA-seq；8例患者使用靶向NGS panel对ctDNA和/或组织活检样本进行了检测。

几项开创性研究探索了尿路上皮癌，重点是局限性疾病中FGFR3变异的频率和其他分子特征。本研究对47例有肿瘤样本WES数据的晚期/转移性尿路上皮癌患者进行了全面的突变图谱分析（图1）。变异频率最高的基因是TP53（51%），FGFR3（34%）和KMT2D（34%）。考虑到对肿瘤/间质成分存在差异的组织活检样本进行bulk RNA-seq分析评估表达谱的局限性，我们探索了39个有RNA-seq数据的样本主要信号通路基因表达的差异。FGFR3驱动和非FGFR3驱动突变的患者样本，除FGFR3 mRNA外，没有明显的特征。具体分析FGFR家族成员表达水平，发现与FGFR3野生型（WT）样本相比，FGFR3驱动突变的样本FGFR3 mRNA强烈显著过表达。相比之下，FGFR1和FGFR4 mRNA仅略低，FGFR2表达无差异。

图1. MATCH-R或MOSCATO研究中进行了WES±RNA-seq的尿路上皮癌患者的突变图谱

选择性FGFR抑制剂治疗进展的患者

然后，重点分析接受选择性FGFR抑制剂治疗的21例患者。12例为膀胱肿瘤，7例为上尿路肿瘤，另外2例两种位置都有。11例携带FGFR3 S249C突变，5例FGFR3::TACC3融合，3例FGFR3 Y373C突变。1例患者（MR904）携带FGFR2::FAM83H-AS1重排，1例（MR103）携带FGFR4 D276N突变（图2）。

图2. FGFR抑制剂治疗进展的尿路上皮癌患者详情

收集厄达替尼（n = 14）、futibatinib（n = 4）或佩米替尼（n = 3）治疗进展后样本。1例患者的最佳反应为完全缓解（CR），12例部分缓解（PR），6例疾病稳定（SD），2例疾病进展（PD）。值得注意的是，所有患者之前都接受过晚期疾病治疗，大多数患者接受FGFR抑制剂作为二线治疗（范围：二至六线），但无法证明患者在FGFR抑制剂之前接受的细胞毒性药物类型与分子变异之间存在明确的相关性。

12例患者有进展后组织活检和ctDNA样本，6例仅有ctDNA样本，3例仅有组织样本。4例患者在厄达替尼或佩米替尼治疗进展后接受了futibatinib治疗。5例患者有额外的ctDNA样本，可以进行纵向分析，其中1例患者厄达替尼和futibatinib治疗进展后进行了组织分子检测。分析了39个进展后样本，包括16个组织和23个ctDNA样本。

尿路上皮癌选择性FGFR抑制剂治疗进展后的分子特征

• FGFR激酶结构域突变

在19例厄达替尼、佩米替尼或futibatinib治疗进展的FGFR3驱动突变的尿路上皮癌患者中，7例患者检测到FGFR3激酶结构域突变（37%；图3A）。5/7例患者（71%）有治疗前组织活检和/或ctDNA样本测序数据，在这些基线样本中未检测到FGFR3激酶结构域突变。值得注意的是，在所有进展后可及的ctDNA和组织样本中检测到FGFR3激活突变。6例患者ctDNA或组织活检样本检测到单个FGFR3激酶结构域突变：N540K，V553L，V553M，V555L，V555M和E587Q（图3A）。患者CTC1845在futibatinib治疗前接受了厄达替尼治疗（PR，67%；PFS，8.6个月），futibatinib治疗进展后，ctDNA除了检出Y373C激活突变外，还检出3个FGFR3激酶结构域突变（N540K、V555L和L608V）（图3A和B）。由于ctDNA扩增子大小的限制，无法评估这4个FGFR3突变的等位基因状态（顺式/反式构型）。

图3. 尿路上皮癌FGFR抑制剂治疗进展后检测到的FGFR激酶结构域突变

患者MR410厄达替尼治疗进展后，FGFR3 E587Q突变仅ctDNA检出，TSC1 S561fs突变组织和液体活检均检出，FGFR3扩增和PIK3CA E726K突变仅组织活检检出（图3B）。

在患者M322厄达替尼“基线”ctDNA样本中，观察到FGFR3::TACC3融合，进展后液体活检中仍检出该变异，变异丰度（VAF）更高，此外还检出FGFR3 V555M突变和TSC2移码突变（P28Lfs；图3C）。

患者MR406经佩米替尼治疗出现轻微的仅胸部进展，与胸内疾病患者ctDNA脱落有限一致，FGFR3 V553L突变仅在组织活检中检测到，未在ctDNA中检测到（图3D）。鉴于组织活检中mRNA的可及性，进行了TOPO-TA克隆，在同一等位基因上观察到FGFR3 S249C和V553L突变，证实了突变与驱动突变以顺式关系发生。

患者MR560 FGFR3 S249C和V555L VAF增加反映了在厄达替尼治疗期间的进展（图3E）。

患者MR86厄达替尼治疗前样本检出驱动突变FGFR3 S249C和PIK3CA E545K突变，组织活检除了检出这两个突变外，还检测到FGFR3 N540K突变（图3F）。

此外，一例尿路上皮癌（MR904）患者检测到FGFR2重排后，三线佩米替尼治疗获得CR（图3G）。进展后（3年零4个月后），ctDNA分析显示FGFR2融合（FGFR2::FAM83H-AS1）以及FGFR2 L551F突变（根据NM _022970.3转录本）。

• PI3K-mTOR通路基因变异

在19例FGFR3驱动突变的尿路上皮癌患者中，11例（58%）进展后和/或基线样本检测到PI3K-mTOR通路基因变异（表1）。

表1. FGFR3驱动突变的尿路上皮癌患者检测到PI3K-mTOR通路基因突变

5个进展后样本检测到PIK3CA激活突变，但3例患者在FGFR抑制剂治疗之前就存在PIK3CA变异（患者MR15，MR86和ST2267）。患者MR15和MR86使用厄达替尼后取得临床缓解，随后进展。患者MR86继发FGFR3 N540K突变，EGFR过度磷酸化[由磷酸化受体酪氨酸激酶（RTK）阵列确定]可能解释了患者MR15的耐药性。相比之下，患者ST2267基线肿瘤检出PIK3CA H1047R突变，对futibatinib原发耐药。患者MR336在厄达替尼治疗期间继发PIK3CA E545K突变，可能是futibatinib耐药的主要原因。

在FGFR抑制剂治疗进展患者中，除PIK3CA突变外，TSC1/2失活突变（5/19）也有较常见（表1）。患者MR410在进展后（厄达替尼）组织和ctDNA中均检测到TSC1 S561fs突变（VAF 69.96%），同时还检测到PIK3CA E726K和FGFR3 E589Q（VAF 31.12%）突变。厄达替尼治疗进展后，患者M322出现TSC2 P28Lfs突变，患者M521出现TSC1 Q865*突变，患者ST701出现TSC1 Q830*突变，患者MR1105在futibatinib进展后出现TSC1 A186fs突变。患者MR246患有FGFR3 S249C驱动突变的膀胱癌，最终厄达替尼治疗进展，ctDNA检测到NF2移码突变和FGFR2 V517M突变。最后，一例对厄达替尼原发耐药的患者（M2057）检测到PTEN C136fs突变。

抑癌基因这些突变的发生率提示，其应被视为克服治疗耐药性的潜在靶标。

分子变异的功能分析和克服策略

• FGFR激酶结构域突变导致选择性FGFR抑制剂耐药

为了评估FGFR3激酶结构域突变对FGFR抑制剂活性的功能影响，我们生成了具有FGFR3::TACC3融合的Ba/F3细胞，携带N540K，V553L，V553M，V555L，V555M或L608V突变。细胞系间的FGFR3::TACC3外源融合蛋白表达水平是均匀的。将Ba/F3细胞暴露于剂量增加的FGFR抑制剂厄达替尼，英菲格拉替尼，佩米替尼，rogaratinib，futibatinib，derazantinib，AZD4547和zoligratinib，确定其相应的IC50值（图4A）。LY2874455对亲代Ba/F3细胞（无FGFR3::TACC3融合）的IC50为87.5 nmol/L，提示该药物对增殖有脱靶效应。鉴于这一结果，以及LY2874455不再处于临床开发阶段，我们没有将其纳入药理学实验。

图4. Ba/F3细胞模型中FGFR2/3激酶结构域突变的功能描述

8种选择性FGFR抑制剂对FGFR3::TACC3 WT驱动的Ba/F3细胞系的IC50值在亚纳摩尔/纳摩尔范围内。每个FGFR3激酶结构域突变使FGFR抑制剂的IC50值异质性增加。所有药物对高频N540K突变的IC50为>100 nmol/L，除了厄达替尼和futibatinib（低5倍）。同样，厄达替尼和futibatinib对守门人V555L/V555M，V553M和L608V突变保持低活性。V553L突变似乎导致对FGFR抑制剂中等程度的耐药性，因为五种抑制剂的IC50值接近10 nmol/L，但厄达替尼、英菲格拉替尼和futibatinib为亚纳摩尔/纳摩尔浓度。值得注意的是，一例使用佩米替尼的患者（MR406）出现该突变（图3A和D）。

为了证实我们的观察结果，在携带FGFR3::TACC3 WT或变异的Ba/F3细胞中，在肝素和酸性FGF（aFGF）刺激的情况下，使用浓度增加的厄达替尼浓度进行了免疫印迹分析。跨模型的细胞内信号分析证实了活力测定。在WT模型中使用低浓度的厄达替尼后，FGFR3、AKT和ERK磷酸化被消除，而N540K、V553M、V555L和L608V突变则需要更高剂量（图4B）。V555M突变使用高剂量FGFR抑制剂，FGFR3磷酸化和细胞内信号传导仍维持。我们证实，与佩米替尼相比，较低浓度的厄达替尼足以消除V553L突变的细胞内信号传导（图4C）。这支持在出现V553L突变的情况下使用厄达替尼进行有效序贯治疗的假设，根据活力测定，英菲格拉替尼和futibatinib也是如此（图4A）。

当携带FGFR3::TACC3 WT，FGFR3:: TACC3 N540K，FGFR3::TACC3 V555L的Ba/F3细胞暴露于30 nmol/L的厄达替尼，该抑制剂只能在WT模型中消除信号传导（图4D）。值得注意的是，在未经治疗的情况下，两个突变的信号传导增加，在N540K突变基础ERK磷酸化方面特别显著，符合N540K突变的“分子制动”性质。

我们还旨在验证FGFR2 L551F突变导致患者MR904对佩米替尼耐药的作用，并寻找对该突变有效的其他药物。我们生成了携带L551F突变的FGFR2::BICC1 Ba/F3细胞，将其暴露于八种FGFR抑制剂（图4E和F）。除了证实L551F突变诱导佩米替尼耐药外，我们的数据显示厄达替尼和futibatinib可以克服该突变。

• 在携带PIK3CA激活突变的FGFR驱动突变的尿路上皮癌耐药模型中，FGFR抑制剂联合PIK3CA抑制剂具有协同作用

为了阐明PIK3CA E545K在FGFR抑制剂耐药中的潜在作用，我们建立了患者衍生模型。在相应的MR86患者来源异种移植（PDX）模型中，厄达替尼和pictilisib（PI3K抑制剂）作为单药或联合使用，评估肿瘤生长。如图5A所示，只有联合治疗可以有效抑制肿瘤生长，提示尽管一开始就存在PIK3CA突变的患者可能对治疗有反应，但PIK3CA E545K突变促进致癌信号传导，靶向该突变似乎与最大化肿瘤反应有关。

图5. FGFR驱动突变的尿路上皮癌患者衍生模型中联合治疗的协同作用

• 使用患者衍生模型鉴定非突变耐药机制

患者MR15患有FGFR3 S249C驱动突变的上尿路尿路上皮肿瘤。厄达替尼治疗进展后，与基线样本相比，组织活检未发现额外的基因变异。建立了PDX和患者来源的细胞系。在确定在患者来源细胞系中八种FGFR抑制剂无法恢复敏感性后，我们进行了磷酸化RTK阵列，发现EGFR过度磷酸化（图5B）。尽管厄达替尼和EGFR抑制剂吉非替尼作为单药对细胞生长抑制没有显著作用，但联合治疗在MR15细胞系中显示出协同作用（图5C）。免疫印迹分析证实，需要双重抑制来抑制细胞内信号传导（图5D）。体内药理学研究证实了厄达替尼联合吉非替尼（作为单药活性低）对抑制MR15 PDX中肿瘤生长的协同作用（图5E）。

讨 论 

FGFR抑制剂在FGFR驱动突变的膀胱癌中的阳性临床数据首先为尿路上皮癌精准医疗提供了概念证明。然而，厄达替尼的ORR为40%，中位PFS为5.5个月，提示尿路上皮癌FGFR靶向治疗领域仍有改善空间。在分子指导的治疗中，了解FGFR抑制剂耐药机制是开发新治疗策略，改善患者总体反应和临床益处的持久性的关键一步。

本研究识别了FGFR驱动突变的尿路上皮癌中FGFR抑制剂耐药的在靶和脱靶机制。我们的数据来自组织活检和ctDNA，具有互补性。如果ctDNA能够捕获肿瘤病灶间的分子异质性，组织活检在低ctDNA脱落的情况下是有用的，特别是当疾病进展仅限于胸部，肿瘤负荷较低时。此外，组织活检可以建立患者衍生模型，这是进一步了解耐药和测试新疗法和联合疗法的重要工具。本研究队列中，5/21例患者（24%）无法确定耐药机制。尽管由于FGFR抑制剂治疗进展后多种分子检测来源的可及性（血液，组织和患者衍生模型），这一“未知耐药机制”比例较低，但当未发现可能导致耐药的突变事件或当肿瘤微环境中的肿瘤细胞外因素导致耐药时，系统地表征耐药原因仍然具有挑战性。

在本研究19例FGFR3驱动突变的尿路上皮癌患者中，7例（37%）在FGFR抑制剂治疗进展后发现FGFR3激酶结构域突变。值得注意的是，耐药时FGFR3激酶结构域的特征与在FGFR2驱动突变的胆管癌中观察到的特征明显不同。在胆管癌患者中，可逆性FGFR抑制剂治疗进展后经常报告多克隆（即多个）FGFR2激酶结构域突变的发生。在本研究中，仅患者CTC1845检测到多个FGFR3激酶结构域突变（N540K，V555L和L608V）。这例既往接受过厄达替尼治疗的患者在futibatinib治疗进展后只有ctDNA可及（缺乏组织活检），无法连续评估突变，并且由于ctDNA扩增子大小的限制，无法确定等位基因状态。Pal及其同事先前曾报道在4例厄达替尼治疗进展的患者中检测到V555L/M和L608V，但只有1例有多克隆表现（V555M和L608V）。除了这两个突变外，我们还首次报道了选择性抑制剂治疗进展后其他FGFR3激酶结构域突变：N540K、V553L、V553M 和 E587Q。除后者外，所有其他突变事件均已在其对应的FGFR2位置（N550K，V563L，V565I/L/F，L618V，根据NM_001144913.1转录本）有报告，提示这些激酶结构域保守残基也是FGFR3激酶结构域耐药热点。虽然本研究样本量有限，很难得出特定突变的发生率，但守门人残基FGFR3 V555和分子制动N540可能为开发新型抑制剂的相关靶点，鉴于其较高的频率和耐药模式。

虽然证实了FGFR3激酶结构域突变在导致对抑制剂耐药方面的作用，但我们的功能研究在识别能够克服在靶耐药的药物方面没有提供信息。唯一的例外是佩米替尼治疗后样本继发V553L突变，厄达替尼、英菲格拉替尼和futibatinib可能有效。值得注意的是，在可逆的FGFR抑制剂中，厄达替尼对FGFR3::TACC3 WT和突变的Ba/F3细胞系的IC50值均最低，这可能解释了在临床试验中其疗效更佳。

免疫印迹和细胞活力分析强调了分子制动（N540K）和守门人（V555L）突变对耐药发生的不同作用。被认为会干扰药物结合的V555L也促进细胞内信号传导，主要表现为ERK磷酸化。后者在存在N540K时更显著，符合N540残基的“分子制动”功能。从这个角度来看，新型抑制剂需要具有更高的效力，应该能够避免由守门人（和其他）突变引起的空间碰撞。

关于FGFR2 L551F突变的功能证据也表明，在FGFR2驱动突变的肿瘤中该突变或可靶向治疗。本研究中患者MR904在佩米替尼治疗进展后出现该突变，在Varghese等人的研究中，FGFR2驱动突变的胆管癌患者英菲格拉替尼治疗进展后有类似的发现（另外一名患者在多克隆FGFR激酶结构域突变的情况下出现L551F）。FGFR2 L551F突变先前没有描述过，本研究数据表明，L551F导致对佩米替尼和英菲格拉替尼耐药，可以通过futibatinib和厄达替尼克服。

除了导致耐药的在靶突变外，我们还识别了尿路上皮肿瘤中FGFR抑制剂耐药时PI3K-mTOR通路高频突变，伴或不伴有FGFR3激酶结构域突变。本研究和尿路上皮肿瘤分子图谱研究显示，在基线样本中PIK3CA和TSC1/2变异与FGFR3不互斥。然而，其在进展后样本中富集，强烈提示其参与耐药。正如患者MR86衍生模型所示，基线PIK3CA激活突变可能不完全能够导致耐药，但可能代表改善反应的合适靶点。既往研究表明，本研究临床样本中观察到的PI3K-mTOR通路变异在其他癌基因驱动突变的疾病中导致靶向治疗进展，是特定抑制剂的合适靶点。

本研究有几个局限。虽然是迄今为止关于该主题的最大研究，但有限的样本人群使本研究结果不具有普遍性。尽管大多数患者治疗前进行了测序分析，但不是所有患者。一些患者没有匹配的进展后组织和ctDNA样本，限制了我们可以获得的分子信息的深度。尽管我们系统地尝试建立患者衍生模型，但相对较低的成功率限制了非基因突变驱动的耐药机制的识别。最后，我们没有从功能上验证TSC1/2突变的作用或其等位基因状态。

总之，本研究首次系统探索了FGFR驱动突变的尿路上皮癌FGFR抑制剂耐药机制。导致耐药的在靶和脱靶分子证据有助于开发新治疗策略，改善患者结局。

参考文献：

Facchinetti F, Hollebecque A, Braye F, Vasseur D, Pradat Y, Bahleda R, Pobel C, Bigot L, Deas O, Florez Arango JD, Guaitoli G, Mizuta H, Combarel D, Tselikas L, Michiels S, Nikolaev SI, Scoazec JY, Ponce-Aix S, Besse B, Olaussen KA, Loriot Y, Friboulet L. Resistance to selective FGFR inhibitors in FGFR-driven urothelial cancer. Cancer Discov. 2023 Jun 28:CD-22-1441. doi: 10.1158/2159-8290.CD-22-1441. Epub ahead of print. PMID: 37377403.