欧启水教授：单细胞测序技术在慢性乙型肝炎临床诊疗中的应用价值

作者：廉芳  欧启水

单位：福建医科大学附属第一医院检验科

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染呈世界范围内流行，2019年全球约有2.96亿慢性感染者，150万新发HBV感染者，尤其是在亚洲和非洲的地区高发。自1982年乙肝疫苗问世，虽能够有效预防HBV感染，但对于感染者彻底清除体内的HBV仍没有很好的治疗方法。近年来，基于基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等高通量单细胞测序技术的发展，疑难疾病将可以从器官组织的单细胞水平异质性、分化和细胞间相互作用等方面进行深入的研究探讨。

01肝脏与主要的免疫细胞

肝脏是一个复杂的器官，由不同的细胞类型组成，具有多种生理功能，包括消化、合成、代谢和解毒。同时它也是一种重要的前哨免疫器官，在抗感染、免疫自稳和抗肿瘤作用中发挥着至关重要的作用。在急性和慢性感染期间，肝脏从耐受状态转变为主动免疫状态，并构成抵御入侵微生物的重要防线。这种免疫力和耐受力之间的平衡对肝脏功能至关重要，在没有感染的情况下过度炎症会导致无菌性肝损伤、组织损伤和重塑；免疫力不足则会导致慢性感染和癌症。

肝脏的防御机制主要取决于复杂的免疫细胞网络，包括库普弗细胞（Kupfer cell，KCs）、树突状细胞（dendritic cell，DC）、中性粒细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）以及B和T淋巴细胞。

肝脏是人体中含有NK细胞数量最多的器官，约占肝内所有淋巴细胞的1/3到1/2。NK细胞利用自身靶向细胞的缺失，可促进细胞活化，产生IFN-γ细胞因子，释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒进行靶向杀伤细胞。近年来有越来越多的研究表明，尽管NK细胞是固有性淋巴细胞，但它们能够产生记忆。虽然不像经典淋巴细胞产生特异性记忆，但它确实会对特定病毒病原体的继发感染产生更快速、更强的免疫反应。常驻于肝脏中最多数量的巨噬细胞为KCs，35%肝脏非实质细胞和90%组织巨噬细胞是KCs。通过血液的流通，KCs细胞可检测到流经其细胞表面的任何异物，将数百万计的红细胞、血小板、免疫细胞以及突破屏障进入血液的少数病原体区分开来。  

02单细胞测序技术

随着高通量单细胞测序技术的发展，可以在单细胞水平上了解重要器官和复杂疾病的异质性、细胞分化和细胞间作用。

1. 单细胞转录组测序：单细胞转录组测序（single cell RNA-Seq，scRNA-seq）可以大规模表征单个细胞的完整转录组。这项测序技术通常流程是组织解离、单细胞捕获、细胞裂解和用细胞条形码标记mRNA，可以用最小的起始样本量进行测序分析。在许多研究中，scRNA-seq已被用于研究理解肝脏病理的表型和致病机制，并获得对疾病病理学和生物学新的见解。scRNA-seq还可避免聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增的偏差。scRNA-seq也可以避免PCR扩增要求，因为它计算的是扩增前核酸序列的实际值，而不是扩增后核酸序列的相对丰度。

2. 单细胞染色质可及性测序：单细胞染色质可及性测序（single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing，scATAC-seq）是一种在单细胞水平上检测染色质开放区和识别调控区的新技术，染色体开放区与相应转录因子或其他调控蛋白的结合直接影响细胞内基因复制和转录的发生。利用Tn5转座酶切割染色质的开放区域，并应用测序适配器进行高通量测序。scATAC-seq是基于GemCode技术构建的微流体平台。

3. 空间转录组测序技术：cRNA-seq能够测量数千个细胞的全基因组表达模式，但这种技术需要从组织解离细胞，使其每个细胞失去了空间背景。将scRNA-seq与标志基因的原位表达相结合可以推断原始组织的空间基因表达位置，这种方法被应用于解释胚胎发育过程中的空间基因表达特征。空间转录组（Spatial transcriptomics，ST）技术最大优点是组织切片的空间Mrna表达高分辨率模式，避免需组织解离造成的缺陷。

03单细胞测序技术在慢性乙型肝炎免疫细胞的应用

HBV是一种嗜肝病毒，通过肝脏免疫和炎症反应诱导肝脏损伤，在机体内建立持久和慢性感染，确切的发病机制尚不清楚。因此，迫切需要解决这一问题，HBV感染的结果是由病毒和宿主免疫反应之间的相互作用决定的。外周血单个核细胞是多种免疫细胞的混合群，在固有性免疫和适应性免疫中发挥动态作用。

随着单细胞测序技术的发展，试图寻找慢性HBV感染、CHB进展为失代偿性肝病或肝细胞癌等相关的特异性细胞类型和相关的调控途径。在慢性HBV感染中，表型NK细胞和功能型NK细胞有发生变化，NK细胞表现出强烈的免疫反应，产生IFNγ能力下降。Xu通过scATAC-seq获得了NK细胞簇，其中1220个来自慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞（CHB-PBMC），占65.17%；另外652个来自健康人群对照的外周血单个核细胞（NC-PBMC），占34.83%。157个峰在CHB-PBMC中特异性表达，在炎症反应、病毒感染和细胞凋亡途径中富集。同时还对NK细胞进行聚类分析，NC组和CHB组比较，获得NK细胞差异TF基序。在NK-0中发现了一个特异性的染色质开放区结合的转录因子，它与乙型肝炎的发展密切相关。NK-1中有10个特异性表达的TF基序。因此，CHB中特异性上调的11个基序对CHB患者NK细胞功能障碍提出新的机制。在CHB组中几乎表达差异的TF基序都包含四个家族，包括Fos相关因子、NF-kappaB相关因子、Jun相关因子和AP-1相关因子。

Zhang在乙型肝炎感染的不同疾病状态下，通过scRNA-seq检测肝脏和血液不同免疫细胞亚群的相互作用。该研究强调了耗竭的CD8+T（Tex）细胞、调节性CD4+T细胞和FCGR3A+巨噬细胞之间的相互作用。介导HLA I类分子及其受体（如白细胞免疫球蛋白样受体）可导致HBV稳定期的免疫失败，可能有助于指导免疫治疗。为了解HBV感染KCs的功能，De通过流式细胞术对C57BL/6小鼠的CD45+CD64+F4/80+肝细胞分选后，进行scRNA-seq分析。在肝脏滞留的巨噬细胞，使用IL-2处理CD45+F4/80+CD11 bint和TIM-4+CD206+ESAM+细胞，依据交叉反应递呈病毒粒子或肝细胞中所含的病毒抗原不同，鉴定出两个不同的KCs簇。因此，KCs的特定亚群被认为是导致HBV特异性CD8+T细胞的肝细胞启动的调节信号通路，这些细胞在IL-2外源性治疗后，可获得致病效应和抗病毒功能。

慢性HBV持续感染是癌症的主要原因之一，调控途径的潜在阻断点可抑制CHB转为癌症。病毒特异性CD8+T细胞有助于控制乙型肝炎病毒感染和肝损伤，Xu对7个T细胞亚群进行生物信息学分析，确定T-3是与慢性乙型肝炎关系最密切的聚类。在信号通路中富集的CHB特异性表达的峰值用于差异表达分析，结果显示由差异峰相关基因YWHAQ富集的TF基序MA0846.1 FOXC2在CHB组中显著上调，而YWHAQ的mRNA表达水平与肝细胞癌患者的预后显著相关。推测YWHAQ在T-3细胞中异常表达，导致基序MA0846.1 FOXC2的上调和FOX因子的增加。Xu报道，癌症治疗的新靶点FOXC2可能通过促进细胞增殖和侵袭在癌症中发挥重要作用。

04问题与展望

CHB给感染者带来沉重的生理、心理和经济负担，全球学者致力于CHB精准的诊疗研究，目前还没有彻底治愈HBV感染有效的方法。使用高通量单细胞测序技术，加深对肝脏生理或病理结构的理解，绘制肝脏和外周免疫微环境的免疫细胞图谱，将有助于进一步了解人类HBV感染的发病机制，而且有助于发现新的免疫靶点或开发临床治愈慢性乙型肝炎的新治疗策略。针对患者的治疗可选择多样化治疗方案，实现个体化精准医疗。然而，单细胞测序技术还存在一些局限性，如扩增时需要尽量提高覆盖率、降低错配率和减少噪音影响，同时建立更完善的生物信息算法等等。总之，单细胞测序技术的应用将大大促进CHB研究进一步发展。

本期编辑：王岩

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