基于GEO数据库的三叉神经痛关键基因筛选及相关免疫细胞浸润分析

包萌萌1 李妍霜2

1首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科，北京 100020；2首都医科大学附属北京朝阳医院乳腺外科，北京 100020

国际麻醉学与复苏杂志,2023,44(08):809-815.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20221102‑00855

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究基于基因表达综合数据库（GEO）的微阵列数据，筛选出三叉神经痛（TN）样本和健康对照（HC）样本之间的差异表达基因（DEG），并进行生物功能分析，以进一步探索所确定的基因的潜在功能。筛选发现了11个关键基因，包括ANXA5、ENO1、CA2、FBP1、CD9、SMPD3、VSTM1、SPNS3、PRSS33、FAS和LENG8，这些基因可能在TN的发病机制中起到关键作用。对这些基因功能和调控的进一步研究可能会促进TN诊断和治疗方法的改进，并最终改善患者的生活质量。

1、资料与方法     

从GEO获取与TN相关的基因表达谱数据集GSE186505，数据集中包含20个样本的芯片数据，其中10个是TN样本，10个是HC样本。用生物信息学方法对高通量测序数据进行标准化、归一化和显著性检验筛选与TN相关的DEG，并进行基因本体GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析探索DEG的潜在生物学功能，通过蛋白质‑蛋白质相互作用（PPI）网络进一步筛选TN相关的关键基因，利用CIBERSORT分析不同样品中免疫细胞的浸润程度。

2、结 果

2.1DEG筛选

GSE186505数据集分析结果显示，筛选出TN样本与HC样本DEG 56个，其中23个上调基因，33个下调基因（表1）。

2.2DEG的GO富集分析和KEGG富集分析

GO富集分析结果显示，上述DEG在BP层面主要富集在细胞对肿瘤坏死因子的反应、半胱氨酸型内肽酶活性的调节等生物学功能中；CC层面主要富集在膜的外在成分、细胞中间体、质膜外侧等成分中；MF层面主要富集于磷脂结合、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性等功能中（图1）。

KEGG富集分析显示，DEG主要富集在嘧啶代谢、糖酵解/糖异生、碳代谢等信号通路中（图2）。

2.3DEG的PPI网络构建及关键基因筛选

将56个DEG上传STRING数据库进行PPI网络分析，并使用Cytoscape软件将结果可视化。可视化PPI分析中节点之间的连接以确定DEG编码的蛋白质之间的相互作用。进一步用cytoHubba插件进行筛选，获得11个TN相关的关键基因：ANXA5、ENO1、CA2、FBP1、CD9、SMPD3、VSTM1、SPNS3、PRSS33、FAS、LENG8，这些基因的功能见表2。

2.4免疫细胞浸润结果

对GSE186505数据集进行了CIBERSORT免疫细胞浸润分析，比较TN样本和HC样本之间免疫细胞的差异和相关性。分析了每个样本中22种免疫细胞的浸润比例，结果显示，幼稚B细胞、M2巨噬细胞在TN样本中表达明显增加，而记忆B细胞、幼稚CD4+ T细胞在HC样本中增加。TN样本各免疫细胞相关性分析结果显示，活化的自然杀伤（NK）细胞与静息树突细胞呈正相关（r=0.84，P=0.003）、与M2巨噬细胞呈正相关（r=0.78，P=0.02）、与静息肥大细胞呈正相关（r=0.77，P=0.02），静息树突细胞与调节性T细胞呈正相关（r=0.63，P=0.005），静息肥大细胞与M2巨噬细胞呈正相关（r=0.67，P=0.01），而活化的NK细胞与静息NK细胞呈负相关（r=−0.59，P=0.01），M2巨噬细胞与单核细胞呈负相关（r=−0.63，P=0.009)，调节性T细胞与激活的记忆CD4+ T细胞呈负相关(r=−0.49，P=0.03)、与中性粒细胞呈负相关(r=−0.52，P=0.001)。综上所述，TN样本和HC样本的免疫细胞浸润存在显著差异。

3、讨 论

本研究通过对微阵列数据集GSE186505进行生物信息学挖掘，筛选出TN样本和HC样本之间的DEG共56个，其中上调基因23个、下调基因33个。利用DEG进行PPI网络分析，共筛选得到11个与TN相关的关键基因：ANXA5、ENO1、CA2、FBP1、CD9、SMPD3、VSTM1、SPNS3、PRSS33、FAS和LENG8，其中FAS和LENG8是下调基因。

以往研究显示，促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）/胞外信号调节激酶（eERK）信号通路参与了神经痛，特别是TN的发病机制。TNF‑α既可以介导细胞凋亡，又可以发挥抗凋亡作用，通过TNF-α受体可激活NF‑κB信号通路和MAPK/ERK信号通路，这一过程可能参与了TN的发病过程。本研究中GO富集分析的BP分析表明，DEG主要富集在“细胞对肿瘤坏死因子的反应”，与上述两项研究结论相呼应。

众多研究揭示代谢变化直接控制免疫应答过程，我们筛选出的11个关键基因，通过参与糖代谢、细胞凋亡、炎症反应、跨膜通道、信号转导等过程，进而影响免疫细胞的效应功能。为了进一步探索免疫细胞浸润在TN中的作用，我们使用CIBERSORT对TN中的免疫细胞浸润进行了系统评估，结果显示幼稚B细胞、M2巨噬细胞在TN样本中表达明显增加，而记忆B细胞、幼稚CD4+ T细胞在HC样本中增加。提示幼稚B细胞和M2巨噬细胞在TN的发病过程中起到重要作用。研究显示：人类的幼稚B细胞及记忆B细胞表达不同的效应细胞因子谱。有证据表明，TN可能是由神经根内的三叉感觉纤维脱髓鞘引起的，或是由较少见的脑干内的脱髓鞘引起。这与本研究中显示TN患者幼稚B细胞及M2巨噬细胞表达增加相互印证，且11个关键基因中的FAS和SMPD3参与调节TNF‑α，这表明免疫细胞以及关键基因在TN的发病机制和进展中起着至关重要的作用。

本研究的局限性：首先，TN的病因尚不完全清楚，这可能与功能紊乱、遗传、细胞凋亡和炎症有关，我们需要进一步的数据挖掘和生物信息学分析；此外，需要进一步的体外和功能研究以及使用基因敲除小鼠的研究来验证这些基因的分子生物学机制。

综上所述，本研究应用生物信息学方法分析并筛选出与TN相关的关键基因，揭示TN可能是通过调节ANXA5、ENO1、CA2、FBP1、CD9、SMPD3、VSTM1、SPNS3、PRSS33、FAS、LENG8等基因，进而激活了细胞对肿瘤坏死因子的反应、跨膜通道、炎症反应等，调动碳代谢、糖代谢、嘧啶代谢等信号通路而发病或进展的。此外，免疫细胞浸润在TN的发病过程中也起到重要作用。本研究为TN的发病机制研究提供了有价值的参考，也为今后进一步研究TN的诊断和治疗靶点提供了新的思路。