针对靶向蛋白降解药物分析，TMT和DIA的优缺点各是什么？

如上篇提到，TMT（Tandem Mass Tag）和DIA（Data Independent Acquisition）都是相对定量蛋白质组学分析技术，均可用于比较不同样品间蛋白含量相对差异。但是TMT技术建立在DDA（Data Dependent Acquisition）采集方法上，会导致质谱数据的采集出现一定的随机性，容易出现鉴定结果不稳定的现象。而DIA方法能够无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。

1.TMT技术的采集特点

TMT技术在质谱数据采集上表现出的随机性会产生较多的缺失信号，进而产生大量的零值问题，这在早期采集频率较低的质谱中尤为突出。作为补偿，TMT将多个样本混在一起进样，最大程度地减少了由于DDA采集随机性引发的大量的零值的问题，这也是早期相对定量蛋白质组学研究主要采用TMT方法的原因。

TMT方法需要在样品酶切为多肽后，进行TMT试剂的标记和分级，然后再进行质谱数据采集。具体流程见图1。

图1.TMT实验流程

经过多步骤的TMT标记操作，样品有所损失并且标记效率也无法达到100%。造成了经过TMT标记的样品鉴定蛋白的数量会减少。为了提高蛋白质鉴定数量，可以对TMT标记混合后的样品进行分级。分级就是将一组TMT标记过的肽段混合物样品，通过高pH反相色谱，根据肽段的疏水性不同将其分成不同的组分，再将不同组分分别进行质谱数据采集。一般来说，需要进行至少约6个分级样品分别进样以上，才能达到直接同 DDA一次进样相近的蛋白质鉴定数量。

2.DIA技术的采集特点

DIA方法的出现大大改善了DDA方法下样品间蛋白数据缺失值的问题，但是如果使用DIA方法，对于质谱性能要求非常高，需要使用Orbitrap 240、480或更高性能的质谱设备才能产出更高质量的DIA数据。在靶向蛋白降解药物分析中，由于会更加关注靶点蛋白的真实降解率，DIA方法在这方面更为合适。这是因为TMT方法对于蛋白的相对量测量值有压缩效应。换句话就是说TMT测量出的蛋白含量差值比真实值要小，造成降解倍数计算不准确。业内公认TMT的压缩效应是由于报告离子混合谱干扰造成的，一些文献也提出了相应的改进方法，见下图。

综合以上内容，我们的建议是在有高性能质谱设备的前提下优先使用DIA方法进行靶向蛋白降解药物的蛋白质组学分析。当然TMT方法在一些特定场合也有其优点，比如在靶蛋白含量极低时，可以使用加大分级数的方法，提高对低丰度靶蛋白的检出可能性（DIA方法一般不适合与分级策略联用）。TMT标记后，进行20-30级以上的分级，然后分别进行质谱上机，当然这也意味着非常高的质谱分析费用。