如何设计高效的Cas12a-crRNA引物

来源：CRISPR那些事儿（公众号）

最近Marraffini团队发表在MC上发表的一篇文献介绍了如何设计高效的Cas13a-crRNA值得我们去学习应用，大家如果有在做Cas13a检测的可以点进去学习一下。

目前对于Cas12a的检测DNA应用较多，今天主要是和大家一起学习一下如何设计高效Cas12a-crRNA引物。下文是发表在nature期刊上的一篇文章，主要是讲crRNA引物设计中次优PAM选择的问题，这篇文献对于解决传统CRISPR一管法检测出现的各种问题有重要意义。

一．设计Cas12a-crRNA引物的关键因素：

PAM对于crRNA引物和靶标序列的识别非常重要，因为Cas12a蛋白识别dsDNA靶标始于PAM序列的识别，从而促进dsDNA靶标的展开，PAM序列是TTTV序列，位于crRNA序列的5’端。对于许多初次接触CRISPR技术的小白很多可能不太了解PAM以及其作用是什么，而PAM基序对于CRISPR/Cas检测至关重要，本文主要是对PAM基序进行了研究，作者主要讲了开发的一种基于Cas12a的方法，并将其命名为sPAMC（针对基于Cas12a的测试的次优PAM（原间隔子相邻基序）。因为在一步法CRISPR检测中，Cas12a的等温扩增和切割反应同时发生在一管中，使用CRISPR RNA（crRNAs）靶向次优PAMs而不是典型PAMs可以将反应速度加快2-3倍。此外，广泛的测试表明，sPAMC比使用典型PAMs的一管法测试显示出更高的灵敏度和可靠性。

二．设计Cas12a-crRNA引物中次优PAM应如何选择?

次优PAM是相对于经典PAM（TTTV）而进行的命名，作者发现，那些性能较好的crRNA都是次优PAM（NTTV和TTNT），而不是典型的PAM（TTTV）。作者进一步确定次优PAM对增强一管反应中Cas12a介导的检测的关键因素。

随后作者又探索了哪些类型的次优PAMs反应更灵敏，人类乳头瘤病毒18型（HPV18）L1基因从TTTV点突变VTTV，TVTV或TTVV，通过大量实验得出结论，大多数VTTV，TCTV和TTVV，以及一些TRTV，TTNT（TTTV除外）的PAMs一管反应优于典型的PAM基序TTTV。

作者通过一系列实验验证了次优PAM对于检测性能灵敏度影响，进一步证实了次优PAM对CRISPR检测一管反应的重要作用。

三．设计Cas12a-crRNA引物为何高效

其作用原理主要是在CRISPR检测一管法反应中恒温扩增反应和Cas酶对靶标的切割反应同时发生，两个反应都需要靶标的参与，对靶标存在竞争关系。而次优PAM则会始Cas酶对靶标的识别减慢，从而减缓对靶标的切割反应，使反应向扩增反应的方向进行。从而使在更低浓度下也能被检测出来。

CRISPR检测原理图

总结：

这篇文章主要是对次优PAM检测性能进行介绍，对于哪些PAM位点有最优的性能也做了实验探究，具体的还需要根据实验的情况来设计，在一管反应中为了保证反应的灵敏度在设计crRNA引物的时候可以使用这种方法。而次优PAM在两管法反应中还是会弱于经典PAM结构的。

在设计Cas12a-crRNA引物除了这个次优PAM的考虑因素，还有引物Spacer序列的选择，引物二级结构等多种因素进行综合考虑。