暨南大学吴政/陈功团队揭示高滴度AAV对大脑的毒副作用

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一类结构简单的单链线性DNA病毒。而复制缺陷型重组腺相关病毒载体(rAAV) 具有安全性好、宿主细胞范围广和在体内表达时间长等特点，因此在基因治疗领域备受欢迎。然而，高剂量AAV导致的毒副作用在基础和临床实验中时有发生，包括在中枢神经系统的毒副作用。因此解析AAV毒副作用的机理，对提高AAV基因治疗产品的安全性具有重要意义。

2023年8月28号，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院吴政研究员和陈功教授团队在Molecular Therapy-M&C发表题为“High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain” 的文章，首次揭示了脑内注射高滴度AAV病毒可以破坏成年小鼠的血脑屏障、诱发淋巴细胞浸润并导致神经毒性作用。

该文首先通过高通量 RNA测序发现了高滴度AAV导致的多达1500多个差异表达基因，其中包括炎症因子上调，血脑屏障（BBB）相关基因的改变，大量趋化因子基因上调，以及适应性免疫反应相关基因的上调。免疫组化揭示当高滴度AAV感染脑实质时，引起大脑内小胶质细胞和星形胶质细胞大量增殖活化。正常生理状态下，由于血脑屏障的存在，限制了免疫细胞的进入，大脑通常被描述为“免疫豁免”器官，但是通过转录组学分析和免疫组化检测，研究人员发现高滴度AAV的大脑内注射会导致大量外周免疫细胞浸润到脑实质，提示高滴度AAV可能破坏了血脑屏障的完整性。

正常状态下，血脑屏障由特化的脑微血管内皮细胞组成，内皮细胞与内皮细胞之间通过紧密连接蛋白连接，并被周细胞和星形胶质细胞终足紧密包裹。为了研究 AAV 对血脑屏障的影响，研究人员首先在成年小鼠大脑内注射了不同剂量AAV，并通过免疫组化和荧光成像发现高滴度AAV造成小鼠大脑血管周围星形胶质细胞的终足结构大量丢失，并且不再包裹微血管。内皮细胞与内皮细胞之间的紧密连接蛋白ZO-1和Occludin也都显著下降，同时血管周细胞大量丢失。这意味着血脑屏障相关成分受到高滴度AAV的严重损伤。研究人员进一步通过将染料注射到小鼠血液循环系统中，发现高剂量AAV造成染料大量泄漏到大脑实质中，提示血脑屏障通透性大大增加。通过双光子活体成像技术同样发现高滴度AAV造成大量的染料泄漏到大脑实质中，揭示了高滴度AAV不仅损伤脑血管成分，也造成血脑屏障功能上的破坏。

图1：通过血管染料和双光子活体成像揭示高滴度AAV造成小鼠大脑血脑屏障破坏

脑血管渗透性增加是否会引起血液中的免疫细胞渗透（浸润）？为此，研究人员通过免疫荧光染色发现了高滴度AAV注射部位存在大量的CD45+白细胞，这种细胞正常情况下大量存在于免疫器官和循环血液中，而不存在于大脑实质中。进一步的研究发现，浸润的白细胞包含大量的免疫毒性细胞（杀伤性T细胞），毒性细胞可以通过释放颗粒酶B（Granzyme B）诱导靶细胞的程序性死亡，从而导致注射部位显著的神经毒性作用。为了减轻高滴度AAV对大脑神经的毒副作用，研究者通过免疫抑制干预的手段，成功地减轻了注射部位附件神经元的丢失。

上述结果提示，高滴度AAV脑内注射会引起毒性免疫细胞浸润，从而杀伤注射部位的神经元，而免疫抑制干预手段可以显著改善高滴度AAV带来的神经毒性作用。

总之，本研究提示在利用AAV作为基因递送载体时，一定要注意病毒滴度对中枢神经系统产生毒副作用的影响，将病毒滴度降到安全范围以内，以免破坏脑血管结构，进而导致免疫细胞浸润。

图2：文章总结结示意图

暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院吴政研究员和陈功教授为本文共同通讯作者，研究生郭耀威为本文第一作者。研究生陈俊良、纪雯宇和徐亮等也为本研究做出重要贡献。

起草人：郭耀威

初审：吴 政

终审：陈 功

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