CRISPR文库筛选常见问题及解决方法--慢病毒包装与转染

CRISPR/Cas9文库筛选技术可实现全基因组范围的高通量筛选，其针对每个基因设计3-10条sgRNA，利用芯片一次性合成数万条覆盖整个基因组的sgRNA探针，通过克隆构建载体库，经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞，使得理论上每个细胞整合一条sgRNA，构建获得覆盖全基因组的基因敲除细胞池；经过筛选后，提取基因组并针对整合的sgRNA序列进行高通量测序，分析筛选前后sgRNA的丰度变化，进而找出其对应候选基因。

在CRISPR文库筛选实验过程中，最理想的结果就是除了药物，其他刺激的影响越小越好，因此病毒必须高滴度、高纯度、无污染。以下整理了一些关于CRISPR文库筛选中慢病毒包装与转染的常见问题及解决方法，希望对你有帮助。

1. 在CRISPR文库筛选实验过程中，慢病毒的转染效率低

原因1：细胞铺板过密

解决方法：铺板密度为4–5 x 10∧6 cells/10 cm培养皿，如果细胞分裂太快，可适当降低铺板细胞数；在汇合度50–80% 时进行实验。

原因2：细胞检测转染效率的时间与转染间隔太短

解决方法：转染后48小时目的基因才能达到最大表达量，此时再进行转染效率测试。

原因3：病毒滴度太低

解决办法：在不使用超速离心的情况下浓缩病毒至100倍。

原因4：在转染时，细胞活性过低

解决办法：（1）病毒包装培养基可能影响细胞生长; 稀释病毒上清或者减少细胞接触病毒时间。（2）正确使用polybrene: 使用滴定的方法确定最佳用量，或缩短处理时间。（3）在转染前先调整好细胞状态。

2. 在CRISPR文库筛选实验过程中，包的慢病毒滴度低 (<10∧5 cfu/ml)

原因1：太早收毒

解决方法：应在转染后48–72 hr 收毒。

原因2：未使用Polybrene，或者不是最佳浓度

解决方法：转染时加入4 μg/ml polybrene 或者优化最佳浓度 (2–12 μg/ml)。

原因3：病毒冻融多次

解决办法：每一次冻融滴度会下降2-4倍，因此应减少冻融次数。

原因4：滴定测量滴度时没有使用最佳筛选浓度

解决办法：在检滴度前应确定好细胞的抗性杀伤曲线，以确定最佳筛选浓度。

3. 转染时细胞产生毒性了怎么办？

原因1：MOI过高

解决办法：滴定法确定最佳病毒用量，稀释病毒。

原因2：Polybrene的毒性导致

解决办法：降低或优化polybrene浓度; 减少感染时间。

原因3：包病毒的细胞上清或者培养基对细胞有毒性

解决办法：使用培养基稀释病毒和收毒。

4. 细胞转染Cas9病毒后死亡或者生长缓慢怎么办？

原因：细胞对Cas9 蛋白表达敏感

解决办法：使用目的细胞滴定Cas9病毒以确保一个病毒进入一个细胞，或者使用另外一种对Cas9不敏感的细胞。

 以上就是关于CRISPR文库筛选中慢病毒包装与转染的常见问题以及解答，希望能帮助到您。

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