质谱鉴定的胰腺导管腺癌天然表位的工程化TCR-T细胞治疗

肿瘤抗原是T细胞治疗诱导肿瘤特异性排斥反应的重要靶点。然而，识别胰腺导管腺癌(PDAC)特异性T细胞表位一直具有挑战性。使用先进的质谱(MS)分析，确定癌症相关的I类MHC结合表位，这些表位由具有不同HLA-A类型的多个PDAC患者共享。在这里，研究了其中一个表位LAMC2 203-211，它是LAMC2蛋白上天然存在的非突变表位。在LAMC2 203-211肽刺激下，克隆了TCR，并用慢病毒载体将其导入Jurkat人T细胞系。发现表达LAMC2 203-211特异性TCR的Jurkat细胞在体外对PDAC细胞具有强大的LAMC2特异性细胞毒作用。此外，在皮下或原位植入的肿瘤来源于HLA-A等位基因匹配和不匹配的PDAC患者的小鼠中，在输注LAMC2靶向T细胞后，肿瘤生长以LAMC2依赖的方式受到抑制。因此，开发了一种基于LAMC2特异性TCR的T细胞治疗策略，可能适用于许多PDAC患者。这是首次采用MS分析来确定PDAC中可能作为PDAC免疫治疗靶点的天然CD8+T细胞表位的研究。

胰腺导管腺癌(PDAC)是全球第四大癌症相关死亡原因，由于其易侵袭和转移，其5年生存率仍然很低。缺乏有效的治疗替代方案和对传统疗法的抗拒导致了较差的结果。因此，过继转移可在体外激活的选定抗原特异性T细胞可能满足改善PDAC患者治疗结果的这一未满足的需求。

在临床前小鼠研究中，间皮素(MSLN)（一种在PDAC组织中高表达的蛋白）的CAR T细胞能够减轻肿瘤负担并延长生存期。然而，最近的临床试验表明，使用MSLN靶向CAR T细胞的治疗效果有限，对PDAC患者的总体生存几乎没有改善，可能是由于CAR T细胞无法渗入促结缔组织肿瘤、CAR T细胞耗尽以及癌症相关成纤维细胞介导的免疫抑制。靶向其他PDAC抗原的CAR T细胞，如CD133、EGFR和HER2，也已在早期临床试验中进行了测试，但显示出有限的疗效。

与通过嵌合B细胞受体结合抗原的CAR T细胞不同，TCR-T细胞疗法使用TCR结合HLA来识别肿瘤细胞表面表达的T细胞抗原或肿瘤细胞呈递的表位。通过这种方式，靶标的范围可以扩大到包括细胞质和核蛋白。研究表明，表达来自MSLN的TCR靶向特定多肽的工程小鼠T细胞可以渗透到基因工程KPC小鼠体内自发形成的促结缔组织瘤。最近，使用单次自体T细胞输注治疗一名进行性转移性PDAC患者，这些自体T细胞经过基因改造以靶向突变的KRAS G12D HLA-C结合表位。对先前标准化疗无效的患者获得了72%的部分缓解。然而，这样的患者候选人非常罕见。

开发PDAC免疫疗法的一个重大挑战是获得更多关于PDAC中免疫优势抗原信息，以及识别免疫优势抗原的适当技术方法。此外，由于癌症免疫编辑的现象，必须针对多个肿瘤抗原来防止肿瘤免疫逃避。因此，鉴定大量的免疫原性PDAC抗原为未来基于表位的PDAC免疫治疗的发展奠定基础是至关重要的。

最近，这里鉴定了多个不同HLA的PDAC患者共有的T细胞表位，并证明鉴定出的表位结合不匹配的HLA分子，并在非HLA型相合患者的外周T细胞中诱导了T细胞反应。这个候选T细胞表位包括属于层粘连蛋白亚基γ2(LAMC2)的一个表位，LAMC2是一种上皮基底膜蛋白。先前的研究表明，通过体外T2结合试验，该LAMC2表位可以很强地结合HLA-A2和HLA-A3分子。有趣的是，LAMC2与胰腺癌和肺癌患者不良的生存结局相关。此外，先前的研究表明，LAMC2有助于肿瘤的侵袭、生长、迁移和各种癌症的转移，使其成为开发癌症治疗的潜在靶点。这里，描述了针对肿瘤相关T细胞表位LAMC2 203-211的特异性TCR在LAMC2上的克隆，并证明了这种TCR在体外和体内的抗肿瘤活性。

材料和方法

细胞系

人PDAC细胞系(HPDE，Panc-1，AsPC-1)和人T细胞系Jurkat。Panc6.03、Panc10.05、Panc9.05和Panc7.078是根据约翰霍普金斯医疗机构审查委员会(JHMI IRB)批准的方案从手术切除的PDAC标本中建立的原发胰腺癌细胞系，并通过DNA和基因表达谱进行认证。

使用LAMC2 203-211肽进行T细胞培养

按JHMI IRB批准的方法收集存档的PBMC，以每孔5×10^6细胞密度接种于24孔板中，用LAMC2 203-211肽(10μg/ml)和IL-7 (20ng/ml)刺激。第3天加入小剂量rIL-2 (20U/ml)。每3天用添加rIL-2(20U/ml)和IL-7(20 ng/ml)的新鲜培养基更换一半的培养基。在存在细胞因子而没有多肽的情况下培养的PBMC被用来提供基线TCR库以供比较。21天后，使用人CD8+T细胞分离试剂盒，通过磁激活细胞分选(MACS)对CD8+T细胞进行分选，并按照10x Genomics Chromium单细胞方案进行处理。然后使用10x Chromium平台进行单细胞TCR测序（图S2）。

LAMC2 203-211多肽刺激后高扩增的TCR克隆如下：

Jurkat细胞中TCR重建

采用OBiO技术合成慢病毒转移载体。TCR1和TCR2的α-链和β-链的可变区与P2A多肽元件相连，形成转基因盒5‘-TCRβ-P2A-TCRα-3’。合成转基因小盒，并将其整合到GFP标记的逆转录病毒载体GL121中(图S3)。P2A连接肽可提高人TCR的表达和功能。为了增加TCR表面的表达，两个TCR链基因的恒定区被小鼠恒定区取代。

将携带TCR1和TCR2的慢病毒转移载体与包装载体pCMV-dR8.91和包膜载体pCMV-VSV-G共转染HEK293T细胞，获得慢病毒颗粒。添加Lipofectamine 2000转染剂。分别于48h和72h收集含有相应慢病毒颗粒的培养上清。

为了建立表达TCR1、TCR2和GL121骨架慢病毒感染细胞系(分别为TCR1-Jurkat、TCR2-Jurkat和GL121-Jurkat)，在polybrene(1:500)存在下将重组慢病毒分别感染人Jurkat T细胞。感染后24h换成正常培养基。

用shRNA建立稳定的LAMC2敲低细胞

细菌甘油储备液LAMC2-shRNA和对照shRNA。按照上述相同的步骤，将扩增的质粒用于生产慢病毒。为了建立稳定的LAMC2基因敲低的Panc10.05细胞系(LAMC2KD Panc10.05)和相应的对照Panc10.05细胞系(shCtr Panc10.05)，将产生的慢病毒转导至生长到70%融合的Panc10.05细胞。感染后24h换成正常培养基。筛选时，在培养基中加入终浓度为1μg/ml的嘌呤霉素。

Jurkat细胞的体外细胞毒性测定

将Panc10.05肿瘤细胞(5×10^3)和转导TCR基因的Jurkat细胞(2.5×10^4)按1:5的比例在肿瘤细胞培养基中于96孔板中培养48h，测定单独培养的Jurkat细胞的基线死亡率。在效靶比为5:1和10:1的条件下测定细胞毒作用，并选择5:1的比例作为最佳条件。使用CytoTox-Fluor™细胞毒性测定试剂盒测量细胞死亡。从单独培养的Jurkat细胞的基线死亡率减去共培养细胞的死亡率，计算出肿瘤细胞的死亡率。

小鼠模型及体内抗肿瘤实验

小鼠：雌性NOD/LtSzPrkdc-scid IL2rγ-tm1Wjl (NSG) (6~8周龄)。

皮下模型：将2×10^6的Panc10.05细胞接种于NSG小鼠两侧皮下。3~5周后，摘取皮下肿瘤，切成∼2mm^3的块，植入8~10周龄NSG小鼠皮下。将小鼠随机分为不同的治疗组。3天后，荷瘤的NSG小鼠被随机分配到指定的治疗组。每周经尾静脉注射指定的Jurkat细胞(1×10^6)，并在每次治疗期间同时注射rIL-2(100U)。每周用卡尺测量肿瘤大小两次。肿瘤测量由对小组分配不知情的研究人员进行。用卡尺测量每个肿瘤的长(L)轴和短(S)轴。肿瘤体积(V)计算为V=(L×S^2)/2。

原位模型：JH029和JH072为来源于胰腺导管腺癌患者的PDX。将小块PDX接种到NSG小鼠两侧皮下。5~8周后，取出皮下肿瘤，切成~2mm^3的块，原位植入8~10周龄NSG小鼠胰腺内。8天后，荷瘤的NSG小鼠被随机分配到指定的治疗组。如上述皮下模型，通过尾静脉每周注射一次指定的Jurkat细胞。用Vevo 750小型动物超声系统每周测量肿瘤大小两次。肿瘤体积(V)计算为V=(L×S^2)/2。

PDAC中潜在T细胞抗原的鉴定及LAMC2作为T细胞治疗靶点的选择

使用pan-HLA I类亲和纯化柱从人PDAC组织中分离出HLA I类限制性多肽，并通过质谱多肽组分析鉴定T细胞表位。通过多肽组分析，确定了多个具有独特的HLA-A等位基因的患者所共有的多个T细胞表位。然后，从共享的表位库中选择了6个表位（如下），它们能够在HLA型匹配和不匹配的患者的PBMC中诱导T细胞反应，如IFN-γ和/或颗粒酶B的产生，用于进一步研究。

使用免疫组织化学(IHC)方法，分析了这6种多肽在人PDAC肿瘤和邻近非肿瘤正常组织中的表达(图1A；图S1A)。在两名患者的PDAC组织标本中发现了LAMC2 203-211表位，该表位由LAMC2蛋白的203到211氨基酸组成，其中一名患者携带的是HLA-A2和A3，另一名患者携带的是HLA-A2和A11。发现LAMC2在侵袭性PDAC肿瘤细胞上高表达，但在正常胰腺组织和癌旁组织(包括组织细胞周围的间质细胞)中检测不到；因此，LAMC2是治疗干预的理想靶点(图1A)。相反，TRAPPC11、ORMDL3和MYL12A在肿瘤组织和癌旁正常组织中均有表达，而ZMYND11和CTNNBIP1在肿瘤组织和癌旁正常组织中均未检测到(图S1A)。

图1 LAMC2的表达模式及其与生存的相关性。

接下来，评估了LAMC2在各种PDAC细胞系中的表达。发现LAMC2在正常胰腺导管上皮细胞系HPDE中低表达，而在大多数PDAC细胞系中高表达(图1B)。来自癌症基因组图谱(TCGA)的数据分析也显示，与正常胰腺组织相比，PDAC肿瘤组织中LAMC2的表达显著增加(图1C)。此外，基于人类蛋白图谱的Kaplan‒Meier生存分析表明，LAMC2高表达的患者的5年生存率(17%)显著低于低表达的患者(71%)(图1D)。综上所述，这些结果提示LAMC2可能是PDAC的潜在抗原靶点。值得注意的是，LAMC2蛋白在甲状腺、唾液腺和骨骼肌中的表达水平相对较低，仅在鼻咽、支气管、结肠、膀胱、输卵管、子宫内膜、乳腺、阑尾和扁桃体中适度表达(图S1B)。然而，LAMC2在肝、肾和脑等重要器官中不表达。因此，预期针对LAMC2的TCR-T细胞疗法将是安全的。此外，LAMC2在基本上所有的PDAC肿瘤中都过表达，在许多其他类型的癌症中超过90%的肿瘤中过表达(图S1C)，表明LAMC2可作为TCR-T细胞治疗的特异性靶点。因此，选择克隆LAMC2 203-211表位特异性TCR来开发TCR-T细胞疗法。

表达LAMC2 203-211特异性TCR的Jurkat细胞对LAMC2+人胰腺癌细胞的体外杀伤作用

为了鉴定LAMC2 203-211特异的TCRs，用人工合成的LAMC2 203-211多肽刺激供者的PBMC，用来鉴定LAMC2 203-211表位。确定了在LAMC2 203-211多肽刺激的CD8+T细胞中，与未刺激的CD8+T细胞中的TCR谱系相比，在LAMC2 203-211多肽刺激的CD8+T细胞中扩增最强劲的7个TCR克隆。选择了2个扩增最强的TCRs(TCR1和TCR2)，并验证了它们对LAMC2 203-211表位的特异性。随后，转导了两个TCR结构(图S3)慢病毒感染人Jurkat细胞，建立TCR1-Jurkat和TCR2-Jurkat细胞系。将慢病毒骨架载体GL121导入Jurkat细胞，建立对照GL121-Jurkat细胞系。用流式细胞仪对表达LAMC2 203-211特异性TCRs或慢病毒骨架载体以及GFP的Jurkat细胞进行分选。

为评估LAMC2 203-211靶向Jurkat细胞对PDAC细胞的杀伤作用，将TCR1、TCR2或GL121感染的Jurkat细胞与人Panc10.05 PDAC细胞(HLA-A1、HLA-A19)共培养，并检测了感染的Jurkat细胞的细胞毒活性。使用Cytotox-Fluor™细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒活性，报告为死亡细胞发光。与Panc10.05细胞共同孵育后，LAMC2 TCR1和TCR2感染的Jurkat细胞显示出显著高于对照GL121-Jurkat细胞的杀伤活性(图2A)。

图2 LAMC2 203-211靶向T细胞在体外表现出对PDAC细胞的细胞毒活性。

为进一步研究TCR1-Jurkat和TCR2-Jurkat细胞表位的特异性，建立了稳定的LAMC2KD Panc10.05细胞系，利用慢病毒携带的shRNA敲低LAMC2的表达，并通过感染携带非哺乳动物对照shRNA的慢病毒建立相应的shCtr Panc10.05细胞系(这些细胞分别被命名为LAMC2KD细胞和shCtr细胞)。RT-PCR和Western blotting证实了LAMC2的敲低效率(图2B和C)。然后，重复上述与LAMC2KD Panc10.05细胞的共培养实验。没有观察到LAMC2 203-211靶向Jurkat细胞和GL121-Jurkat细胞之间的细胞毒活性有任何显著差异(图2D)。综上所述，这些结果表明LAMC2的TCR1和TCR2是LAMC2所特有的。此外，还发现，TCR2-Jurkat细胞作为LAMC2 203-211靶向Jurkat细胞的代表，可以有效地杀伤其他人PDAC细胞，即Panc-1(HLA-A2，A11)和Panc7.078(HLA-A2)细胞(图S4)。这一发现表明，LAMC2 203-211表位可能由不同的HLA I类分子等位基因呈现，并且LAMC2 203-211靶向Jurkat细胞可以在大多数患者中诱导靶向特异性地消除表达该表位的肿瘤细胞。

靶向LAMC2 203-211 T细胞过继转移抑制体内胰腺癌模型的肿瘤生长

评估LAMC2 203-211靶向PDAC中TCR1和TCR2感染的Jurkat细胞的体内抗肿瘤作用。首先，通过将Panc10.05细胞来源的肿瘤立方块移植到NSG小鼠皮下建立了PDAC的异种移植小鼠模型。肿瘤移植3天后，小鼠每周静脉注射TCR1-Jurkat、TCR2-Jurkat或对照GL121-Jurkat细胞过继转移(图3A)。rIL-2与T细胞联合应用。结果表明，LAMC2 203-211靶向TCR1和TCR2感染的Jurkat T细胞显示出抗肿瘤活性(图3B)。还测试了以LAMC2 203-211为靶点的Jurkat细胞在两个PDAC患者来源的肿瘤移植(PDX)小鼠模型JH029(HLA-A2，HLA-A31)和JH072(HLA-A1，HLA-A68)中控制肿瘤生长的能力。与之前的发现一致，JH029和JH072在过继转移TCR1-Jurkat或TCR2-Jurkat细胞后的小鼠生长速度都明显低于GL121-Jurkat细胞(图3C)。综上所述，这些结果表明，无论是HLA匹配的还是不匹配的PDAC都可以在体内被LAMC2 203-211的T细胞靶向。

图3 过继转移LAMC2 203-211靶向T细胞抑制小鼠肿瘤生长。

过继转移LAMC2 203-211靶向T细胞不能抑制LAMC2缺陷肿瘤的生长

然后，进一步评估LAMC2 203-211靶向T细胞体内抗肿瘤活性的特异性。将携带LAMC2KD的Panc10.05细胞和慢病毒感染的表达非哺乳动物shRNA对照(shCtr)的Panc10.05细胞接种于肿瘤(分别命名为LAMC2KD肿瘤和shCtr肿瘤)。遵循上述相同的治疗方案(图3)，小鼠在肿瘤植入3天后开始接受TCR2-Jurkat细胞作为代表的每周注射(共4周)靶向T细胞、GL121-Jurkat细胞或PBS作为对照。

发现在PBS治疗组中LAMC2KD肿瘤的生长速度慢于shCtr肿瘤(图4A)。这一发现进一步表明LAMC2可能在PDAC中发挥重要的促肿瘤作用。与上述发现一致(图3)，发现与GL121-Jukat细胞相比，TCR2-Jurkat细胞显著抑制了shCtr肿瘤的生长(图4B)。相反，在LAMC2KD肿瘤中没有观察到TCR2-Jurkat细胞对肿瘤生长的抑制作用(图4C)。综上所述，这些结果表明，LAMC2 203-211靶向的T细胞可以以LAMC2依赖的方式抑制PDAC肿瘤的生长。

图4 LAMC2基因敲低可减少肿瘤生长并消除LAMC2 203-211靶向T细胞介导的小鼠肿瘤生长抑制。

还监测了LAMC2 203-211靶向T细胞的毒性，直到将每周输注LAMC2 203-211-Jurkat细胞的次数增加到4次(图4)，才观察到毒性。观察了与治疗相关的毒性，包括活动能力下降和驼背姿势。这种毒性并不局限于LAMC2 TCR感染的Jurkat细胞或GL121-Jurkat细胞。然而，在输注前通过过滤器过滤Jurkat细胞后，在重复实验中不再观察到与第4次Jurkat细胞输注相关的毒性。

总结与讨论

这是第一次使用质谱鉴定的MHC I类限制性表位来开发用于抗癌TCR-T细胞治疗的工程化TCR的研究。在使用质谱学方法进行的研究中，鉴定了多个PDAC T细胞表位，它们可以结合多个等位基因的HLA-A，并在来自HLA相合和不相合患者的PBMC中诱导T细胞反应。目前的研究表明，其中一个表位LAMC2 203-211是基于T细胞的针对PDAC的免疫治疗的有前景的靶点。首先，发现LAMC2在包括PDAC在内的许多实体瘤中都有高表达。然而，该蛋白仅在正常组织类型中适度表达，包括瘤旁正常胰腺组织和其他器官的正常组织。此外，在所有与PDAC相关的候选肿瘤中，LAMC2的表达与预后不良相关。第二，LAMC2 203-211靶向T细胞抑制了人PDAC细胞来源的异种移植和患者来源的异种原位移植小鼠模型中的肿瘤生长。总而言之，这些发现首次证明了使用质谱来鉴定与癌症相关的CD8+T细胞抗原并开发针对这些抗原的T细胞疗法的可行性。此外，研究表明，通过这种方法开发的TCR-T细胞疗法可能对没有HLA-A型限制的患者有效。

目前这项研究中检查的其他表位可能不是基于T细胞的治疗的理想靶点，但仍可能是疫苗开发的候选表位。为TCR-T细胞治疗开发选择表位的替代方法包括通过蛋白质组学方法基于差异表达或基于使用shRNA基因敲低或CRISPR基因敲除方法的功能评估高通量筛选靶点。然而，这些系统筛查方法是耗时的。将通过系统筛选的方法为TCR-T细胞治疗选择更多的表位。

在其之前的研究中证明了LAMC2 203-211表位可以与不匹配的HLA-A分子结合，并在非HLA相合患者的PBMC中诱导T细胞反应。在这项研究中，发现LAMC2 203-211靶向的T细胞可以抑制表达各种HLA-A等位基因的肿瘤的生长，即来自患者JH029(HLA-A2，HLA-A31)和JH072(HLA-A1，HLA-A68)的PDX。尽管确切的机制尚不清楚，但表位特异的TCR有可能结合具有同源特征的密切相关的HLA-A分子。因此，研究表明，有可能开发现成的TCR-T疗法。然而，LAMC2靶向的TCRs是否能与肿瘤细胞呈递的LAMC2 203-211表位结合在不同的HLA-A等位基因患者身上仍有待人患者研究的证实。另一个警告是，根据之前的研究，LAMC2 203-211是由大约20%-30%的PDAC中的MHC分子提呈的。可以改善PDAC中抗原提呈的治疗，例如通过靶向自噬，可能需要与LAMC2 203-211靶向T细胞治疗相结合才能产生有效的结果。此外，TCR-T细胞治疗方法允许进一步研究T细胞对来自PDAC肿瘤微环境的免疫抑制信号的反应，以及随后在TCR-T细胞中对这些信号进行体外修饰以克服这些免疫抑制信号。

当将TCR2或GL121-Jurkat细胞的输注增加到每周4次剂量时，观察到了与治疗相关的毒性，在小鼠身上表现为行动能力下降和驼背姿势。不能排除这些毒性是由移植物抗宿主病(GvHD)引起的。然而，在输注前通过细胞过滤器过滤Jurkat细胞后，在重复的实验中不再观察到这些毒性。观察到的毒性可能是由聚集的Jurkat细胞引起的。LAMC2 203-211表位位于LAMC2的保守区，但目前尚不清楚该表位是否能由小鼠的HLA分子呈递。将使用人TCR恒定区将LAMC2 203-211特异性TCR克隆到临床级载体中，以最大限度地减少不良免疫原性反应。将进一步测试LAMC2 203-211表位是否能与非人类灵长类动物的HLA分子结合，并随后检测LAMC2 203-211 TCRs的“on-target/off-tumor”毒性。

总之，研究支持使用质谱鉴定的T细胞表位来开发TCR-T细胞疗法的可行性，并证明了靶向特异性LAMC2 203-211 TCR-T细胞疗法的体外和体内抗肿瘤活性。这种TCR-T细胞治疗与针对其他PDAC抗原的T细胞治疗相结合的临床前进一步发展是有必要的。此外，新辅助疗法，如GVAX癌症疫苗，也应与LAMC2 203-211 TCR-T细胞疗法联合检查，因为它们可能改善PDAC抗原提呈，从而与T细胞疗法协同作用。由于LAMC2在许多其他类型的实体肿瘤中高度表达，这种基于LAMC2的TCR-T细胞疗法应该在其他实体肿瘤的临床前模型中进行测试。更重要的是，希望该研究将为识别其他肿瘤抗原打开大门，并帮助开发未来基于表位的免疫疗法。

K. Chen, et al., Single cell RNA-seq reveals the CCL5/SDC1 receptor-ligand interaction between T cells and tumor cells in pancreatic cancer, Cancer Lett. 545 (2022), 215834.

N. Ishimwe, et al, Autophagy regulation as a promising approach for improving cancer immunotherapy, Cancer Lett. 475 (2020) 34–42.

K. Fujiwara, et al., Direct identification of HLA class I and class II-restricted T cell epitopes in pancreatic cancer tissues by mass spectrometry, J. Hematol. Oncol. 15 (1) (2022) 154.

Wang J, et al. Engineered TCR T-cell therapy targeting mass spectrometry-identified natural epitope in PDAC. Cancer Lett. 573 (2023), 216366.

R. Leidner, et al., Neoantigen T-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer, N. Engl. J. Med. 386 (22) (2022) 2112–2119.