CRISPR/Cas系统原理及Cas9与Cas12a区别

2023
11/01

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艾迪基因
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从多方面入手,详细介绍CRISPR/Cas系统中Cas9蛋白和Cas12a蛋白的区别

一、CRISPR/Cas系统简介

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌保护自身免受外来遗传物质影响的适应性免疫系统,该系统发挥功能包括三个阶段:第一阶段是适应,细菌通过特定Cas蛋白从入侵的核酸中识别PAM位点(原间隔序列相邻序列)并将原间隔序列整合到细菌自身的CRISPR序列中;第二阶段是表达和成熟,CRISPR转录为pre-crRNA(RNA前体物),通过酶加工为成熟的crRNA,与Cas蛋白结合形成复合物;第三阶段是干扰,crRNA引导复合物识别入侵核酸PAM靶点,并激活Cas蛋白内切酶活性,切割目标DNA序列。

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二、CRISPR/Cas系统分类

CRISPR/Cas系统分为两类六型,1类包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型,通过多个Cas蛋白发挥功能,占已鉴定CRISPR/Cas位点的90%;2类包括Ⅱ型(Cas9)、Ⅴ型(Cas12)和Ⅵ型(Cas13),通过单一的Cas蛋白发挥功能,占已鉴定CRISPR/Cas位点的10%,是理想的基因编辑和体外检测工具。

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三、Cas12a与Cas9的区别

1.crRNA

对于Cas9,当外源核酸入侵后,细菌会转录出tracrRNA,同时Cas9蛋白被转录翻译,而Cas1、Cas2和Csn2会附着在Cas9蛋白上;然后CRISPR序列在前导区的调控下转录生成Pre-crRNA,Pre-crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对形成双链RNA,同时与Cas9蛋白组装形成复合体,最终根据入侵核酸的类型选取对应的间隔序列,利用RNaseⅢ去掉其他无关序列,形成成熟的sgRNA(single guild RNA)。

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而Cas12a由于具有核糖核酸内切酶活性,当pre-crRNA转录后,Cas12a可直接将pre-crRNA直接加工成熟,无需tracrRNA和RNaseⅢ的参与,同时Cas12a还具有RNA引导的DNase活性,能对靶DNA进行裂解。                                                                                                                                             

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2.PAM位点和结构域

Cas9靶向DNA序列的PAM为5’-NGG-3’,位于非目标链间隔序列下游。Cas9核酸内切酶包括一个HNH核酸酶结构域和一个RuvC-like核酸酶结构域,两个结构域都用于切割DNA,其中HNH核酸酶结构域切割与crRNA互补的DNA链,而RuvC-like结构域切割另一条非互补链,切割位点为PAM上游原始间隔序列第3和第4个核苷酸之间,产生平末端的DSB。

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Cas12a识别富含T的PAM序列,如LbCas12a的PAM序列为5’-TTTN-3’,FnCas12a的PAM序列为5’-TTN-3’,位于非目标链间隔序列上游。Cas12a由REC叶和Nuc叶组成双叶结构,Cas12a具有切割能力的结构域位于Nuc叶上。Nuc叶由RuvC结构域、PI结构域和WED结构域组成,其中用于处理自身crRNA的RNase位点位于WED结构域;用于切割DNA的DNase位点位于Nuc和RuvC结构域之间的界面上,并且Ruvc结构域含有催化中心,能够准确识别目标序列,并在Mg2+的催化下进行精确的DNA切割,产生粘性末端的DSB。

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3.作用机制

Cas9切割DNA使双链断裂后,细胞启动DNA损伤修复机制修复DSB。细胞中存在两种不同的修复机制,一种为非同源末端连接(NHEJ),这种修复方式可能会产生小片段的插入、缺失和替换,且当插入或缺失的碱基长度非3的倍数,就会导致该基因在后续翻译时产生的氨基酸与原基因翻译的氨基酸完全不同,达到基因KO的目的;另一种修复机制为同源重组介导的修复(HDR),这种修复方式修复后DNA双链与断裂前一致,但细胞内主要的修复方式往往是NHEJ,且即使DNA通过HDR修复后也还是会继续被sgRNA识别并再一次进行切割。

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Cas12a的RuvC结构域中存在几个特殊部位:REC Linker(简称Linker),又称为Rec连接子,是连接REC1和REC2结构域的环状连接肽;Lid,在关闭载脂蛋白的催化位点方面发挥作用;Finger:REC1中的指状螺旋结构。在crRNA和靶DNA杂交之前,Lid关闭,Linker和Finger静默;crRNA和靶DNA杂交后,Lid打开,使Cas12a催化口袋可用;当Cas12a切割双链DNA后,Lid改变构象形成α螺旋,从而与杂化组装的crRNA相互作用,Linker和Finger使REC结构域远离RuvC结构域,此时dsDNA底物远端部分与复合物分离后,该部位催化位点暴露,可以无差别切割周围的ssDNA,称为反式切割。这种无差别切割可以将信号方法,结合探针,可以开发出更简便、更快速、更精准的体外检测方法——CRISPR检测!www.edgene.cn

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四、总结

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酶活性对比图

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LbCas12a活性对比测试

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LwaCas13a活性对比测试

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