IgA可以触发比IgG更强的Fc受体信号介导更优越的肿瘤杀伤

二十多年前一种针对B细胞上表达的CD20的IgG单克隆抗体（mAb）——利妥昔单抗成功引入后，越来越多的癌症治疗IgG mAb投入临床，并有效提高了患者的预期寿命。这些单克隆抗体多数是通过F(ab’)2结构域干扰靶功能，或通过C1q与肿瘤细胞表面聚集的Fc结构域结合后，诱导补体依赖性细胞毒性（CDC）直接发挥作用。除了CDC，IgG Fc结构域与免疫细胞上表达的Fcγ受体（FcγR）结合可引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性/吞噬（ADCC/P）作用。

目前所有用于癌症的治疗性mAb均基于IgG同种型。究其原因，主要是IgG广泛存在于体内，且半衰期长，再加上人类对IgG同种型有大量基础知识和生物技术知识的积累。携带FcR的免疫效应细胞通过与IgG调理肿瘤细胞的IgG Fc结构域结合，在癌症治疗的抗体疗法中发挥着重要作用。由于这些治疗剂基于IgG的形式，免疫细胞只能采用FcγR介导的ADCC、ADCP和/或ADCT机制。触发ADCC/P的IgG mAb首先通过FcγRIIIa或者不同的激活FcγR激活NK细胞或单核/巨噬细胞。在细胞质结构域或通过FcR相关的γ链，经ITAM（基于免疫受体酪氨酸的激活基序）激活FcR信号。抗体与FcR交联后，ITAM根据免疫细胞类型结合并激活Lyn/Fyn酪氨酸激酶。随后，磷酸化的ITAM将募集和激活Syk，然后激活SOS、Ras、Rac、PKC、PI3K，最后是ERK或MAP激酶，诱导基因转录细胞因子、炎症介质、杀菌酶、细胞骨架的激活，这些共同导致ADCC、吞噬作用、细胞迁移和脱粒。这些通路在不同的激活Fc受体和Ig同种型之间存在差异，最近研究发现其他同种型如IgA和IgE，也有望用于肿瘤治疗。

IgA已被证明在体内对肿瘤细胞是有效的，IgA同种型可以通过单体IgA活化Fc受体（FcαRI），引发强大的抗肿瘤反应。IgA的肿瘤杀伤作用很大程度上取决于FcαRI（单体IgA的骨髓Fc受体）的存在。在表达FcαRI的先天免疫细胞中，中性粒细胞在消除IgA调理的肿瘤细胞方面特别活跃。中性粒细胞是体内最丰富的免疫细胞，占循环白细胞的70%；它们在体内迁移并监视组织（包括恶性肿瘤），通过Trogoptosis效应机制导抗体诱导的抗肿瘤作用。受刺激的中性粒细胞在与抗体结合后触发胞啃作用，引发调理细胞死亡，这个过程也被称为ADCT（抗体依赖性细胞介导的胞啃作用）。为了研究IgA介导的中性粒细胞肿瘤杀伤作用的潜在机制。研究人员从51Cr释放、活细胞成像、中性粒细胞上的定量FcR表达水平、FcR与IgG/IgA结合能力以及p-ERK动力学等几个方面进行了分析。

结果

1. 与IgG相比，IgA介导的肿瘤细胞中性粒细胞毒性更强

与IgG相比，IgA调理的肿瘤细胞可以被新鲜分离的中性粒细胞有效杀死。研究人员使用三个靶标（CD20、HER2和EGFR）和从健康供体中新鲜分离的未受刺激的中性粒细胞进行了51Cr释放测定（图1）。在较宽的浓度范围内滴定mAb，相似浓度下，IgA实现了最大裂解量（图1A-C）。在每个靶点两个细胞系的肿瘤细胞裂解实验中，尽管实验中mAb、细胞系及中性粒细胞供体各不相同，但IgA的表现始终优于IgG（图1D）。

2. IgA存在时中性粒细胞可迅速对IgA调理细胞做出反应

运用活细胞成像技术对抗体介导的中性粒细胞肿瘤杀伤过程进行了可视化分析。研究发现，中性粒细胞在抗HER2 IgA存在的情况下对A431-HER2调理细胞迅速作出反应，在抗HER2 IgG（曲妥珠单抗）存在的情况下，A431-HER2细胞不会引起中性粒细胞的明确募集，仅观察到最小相互作用（图1E）。在IgA存在的情况下，肿瘤细胞在30分钟内死亡，如红色荧光所示。EGFR和CD20的靶细胞成像实验也观察到相似的动力学现象。活细胞成像实验证实了IgA在中性粒细胞介导的三种不同靶标的肿瘤细胞杀伤作用优于IgG。

图1：与IgG相比，IgA介导更高的人中性粒细胞肿瘤杀伤作用。（A-D）分离的人中性粒细胞（E:T = 40:1）通过4小时51Cr释放试验特异性溶解肿瘤细胞。CD20、HER2、EGFR抗体分别作用于Ramos和EL4-CD20、SK-BR-3和Ba/F3-HER2、A431和A1207细胞。（A-C）使用IgA和IgG抗体的宽滴定范围特异性裂解指定的靶细胞。（D）除Ramos细胞（13.3µg/mL）和A1207细胞（1µg/mL）外，其余靶细胞IgG和IgA抗体的抗体浓度均为10µg/mL。Ctrl为无抗体状态（0.001µg/mL CD20 IgG1抗体处理Ramos细胞）。一个图表代表n = 4-6个不同健康供体的独立实验，p < 0.001: ***， p < 0.0001: ****，未配对t检验。（E）活细胞显微镜下黏附的A431-HER2细胞（钙黄素标记）和中性粒细胞的静态图片，5µg/mL抗HER2 IgA2或IgG（曲妥珠单抗）和死细胞核染料TO-PRO-3（红色荧光）存在，时间以分钟为单位，每30秒采集一次图像，持续1.5 h。

3. 中性粒细胞上的IgA受体FcαRI表达量显著低于IgG受体FcγRIIa和FcγRIIIa

对FcγRIIIb的作用及其FcR表达水平的研究发现，中性粒细胞的FcαRI表达比FcγRIIa（中性粒细胞上的活化FcγR）低约2倍，GPI连接的FcγRIIIb的表达比FcγRIIa和FcαRI至少高10倍（图2A）。尽管FcγRIIIb是一种GPI连接的蛋白质并且不能自行发出信号，但它会干扰Fc介导的作用。FcγRIIIb的大量表达可能通过阻止质膜上的最佳FcγRIIa组织来干扰高效ITAM信号通路和触发中性粒细胞效应器功能。但在51Cr释放试验中，用3G8 mAb F（ab'）2阻断FcγRIIIb，仅略微改善了IgG介导的肿瘤细胞裂解（图2B），未能使IgG诱导的肿瘤细胞裂解恢复到IgA所达到的水平。

图2：阻断FcγRIIIb只能略微改善肿瘤细胞裂解。（A）流式细胞术（Qifikit）分析的FcγR和FcαRI在人类中性粒细胞上的定量表达，n=6-11名健康供体。（B）使用EL4-CD20与抗CD20 IgA2或IgG1（利妥昔单抗）、SK-BR-3与抗HER2I gA1或IgG1、A431与抗EGFR IgA2或IgG1进行3小时51Cr释放测定，所有剂量均为10ug/毫升。在ADCC测定开始前15分钟加入3G8 F（ab'）2片段（1ug/mL终浓度）。统计：Tukey多重比较检验的单因素方差分析，p<0.05：*，p<0.01：**，p<0.0001：****，Ctrl表示未添加抗体。

4. 中性粒细胞与IgA或IgG具有相似的结合特性

尽管与FcγR相比FcαRI的表达较低，但中性粒细胞与IgA结合表面的结合至少与IgG一样好。单体IgA与FcαRI、单体IgG与FcγRIIa/FcγRIIIb的结合亲和力处于低亲和力范围内，据报道Ka<107M-1，因此IgA/IgG与FcR的结合被认为是短暂的。仅当FcR与抗体结合表面多重相互作用的效价增加时，才能实现抗体与FcR的高亲和力稳定结合。来自健康供体的未受刺激原代中性粒细胞用钙黄绿素标记，使其与包被在孔板上的抗体结合（图3A-D）。多次洗涤后测量到中性粒细胞与HER2 IgA涂层的珠子结合更强（图3A），但结果因供体/抗体靶标不同而异（图3B、D）。对用CD20或HER2抗体包被的珠子进一步分析IgA显示出更多聚集趋势，因此与IgG相比，与IgA的结合更好，但未达到统计学意义（图3F、G）。使用LigandTracer技术探索中性粒细胞与调理靶细胞的结合动力学。钙黄绿素标记的原代中性粒细胞与抗CD20 IgA或IgG调理的Daudi细胞结合，如图3H所示。在去除未结合的中性粒细胞后，及时进一步监测剩余的中性粒细胞以研究中性粒细胞-Daudi相互作用的稳定性。IgA和IgG介导的中性粒细胞结合之间无显著差异（图3I）。然而，当使用IgA时Daudi：neutrophil复合物的稳定性增加（图3J），但未达到显著性。

图3：中性粒细胞显示出与IgA、IgG表面相似的结合特性。（A）供体的相对结合示例，其中钙黄绿素标记的中性粒细胞与抗CD20 IgA2或IgG1（克隆UMAB001）包被的96孔板结合。在重复洗涤步骤后测量剩余的钙黄绿素荧光。第一次洗涤前的钙黄绿素荧光设置为100%。Ctrl表示在包被期间未使用抗体。（B-D）与A中一样，但在洗涤10时，6-9个不同供体的数据被合并，每个目标是抗CD20 IgA2或IgG1（克隆UMAB001）或抗HER2 IgA2或IgG1。每种颜色表示来自同一捐赠者的数据。统计：Tukey多重比较检验的双向ANOVA，p<0.0001：****。（E）中性粒细胞与白蛋白、抗CD20 IgA或IgG涂层珠子结合的示例图像（珠子：中性粒细胞=5:1）。聚集的珠子被定义为结合5个或更多珠子的细胞。（F，G）用中性粒细胞定量抗CD20或抗HER2涂层珠子的聚集的珠子（显示了n=3个单独实验）。根据Tukey多重比较检验的单向方差分析，差异不显著。（H）钙黄绿素标记的中性粒细胞与抗CD20 IgA-（红色）或IgG-（黑色）调理过的Daudi细胞结合痕迹（n=5）。（I）绑定关联，（J）来自5个不同供体的Daudi：中性粒细胞复合体的平均半衰期，统计：配对t检验。

5. IgA引发比IgG更强的ITAM信号传导

中性粒细胞在FcR结合后发挥其效应功能，需要ITAM信号传导。研究人员测量了与抗体包被表面结合后中性粒细胞中信号传导的大小。免疫印迹分析显示，当中性粒细胞与IgA包被的珠子相互作用5分钟后，会出现快速而强烈的磷酸化ERK（p-ERK）信号，而IgG包被的珠子仅诱导微弱的p-ERK信号（图4A-D）。使用不同供体的中性粒细胞，实验结果一致。在51Cr释放试验中加入信号级联中作用于ERK的上游的PI3K抑制剂wortmannin、Ly294002以及MEK1/2抑制剂U0126。这些药理学抑制剂的存在导致肿瘤细胞裂解显著减少（图4E）。

图4：中性粒细胞中由IgA引发的p-ERK信号强。（A，B）暴露于抗CD20或抗HER2I gA2或IgG1包被的Dynabeads后，中性粒细胞中p-ERK信号的随着时间而变化。在破坏p-ERK或总ERK信号后，在同一印迹上进行肌动蛋白检测。（C，D）信号量化定义为标准化p-ERK/肌动蛋白与标准化总ERK/肌动蛋白的比率。（E）4小时使用SK-BR-3和抗HER2 IgA2或IgG1进行51Cr释放测定，两者均为1ug/mL。信号因子的药理学抑制剂wortmannin 0.5μM、Ly294002和U0126 20μM。统计：Tukey多重比较检验的双向ANOVA p<0.05:*,p<0.01:**,p<0.001:***,p<0.0001:****。

6. IgA介导的中性粒细胞肿瘤杀伤模型

通过信号传导的数量差异生成了一个模型，其中中性粒细胞中FcαRI信号传导比FcγRIIa信号传导更强，与IgG相比，IgA介导更强的中性粒细胞肿瘤杀伤作用（图5）。中性粒细胞表达低亲和力Fc受体FcγRIIIb、FcγRIIa和FcαRI。FcγRIIa和FcαRI都是激活Fc受体，因为在配体（抗体Fc结构域）结合、激酶（例如Lyn）聚集和募集时，它们通过其ITAM结构域发出信号并引发细胞效应器功能。中性粒细胞上相对较高的FcγRIIIb表达可能通过竞争Fc结构域结合和阻止脂质双层内信号平台/组织的正确形成来干扰FcγRIIa的激活能力。这导致FcγRIIa在中性粒细胞中无法启动足够的信号。尽管中性粒细胞上的FcαRI表达较低，但它们仍能与聚集的IgA Fc结构域结合，其程度与IgG Fc-FcγR相似。此外，IgA以双价结合FcαRI，导致更稳定的结合和4个ITAMs募集。这种情况将启动激活效应器功能（包括消除肿瘤细胞的ADCT作用）所必需的强大ITAM信号传导。在体外实验中，信号通路抑制剂wortmannin、Ly294002和U0126可阻止肿瘤细胞的裂解，进一步说明了这一点。

图5：IgA介导的中性粒细胞肿瘤杀伤模型。图中问号是指涉及信号传导、细胞内Ca2+、肌动蛋白-肌球蛋白收缩和免疫细胞-肿瘤细胞相互作用的尚不清楚的过程，这些过程会导致中性粒细胞的ADDC（trogoptosis）。

讨论

以往研究表明，中性粒细胞介导的最大IgG杀伤通常比NK细胞介导的IgG杀伤更高。与IgA诱导的中性粒细胞裂解相比，IgG介导的NK细胞杀伤在较低抗体浓度下似乎更有效。体外实验发现，对于三个靶点（CD20、EGFR和HER2），IgA同型在触发未受刺激的中性粒细胞杀死肿瘤细胞方面比IgG更有效。Fc受体的表达、结合和信号转导相关实验表明，中性粒细胞上的FcαRI表达比Fcγ受体FcγRIIa低~2倍，比FcγRIIIb低~20倍，但IgA或IgG与中性粒细胞的结合依然相似。但与IgG相比，IgA介导的中性粒细胞结合更稳定。通过p-ERK信号分子测定，发现中性粒细胞与IgA结合会引发比IgG更强的Fc受体信号。FcαRI参与时非常强的ITAM信号传导解释了IgA有效的中性粒细胞效应器功能。

中性粒细胞上FcαRI表达较低，但与IgG的相似结合及其强大的IgA诱导信号表明两种同种型抗体FcR参与方式的根本差异。FcαRI能够以1:1或2:1（FcαRI:IgA）的化学计量比与IgA相互作用（图5）。FcαRI与IgA的二价结合会导致更强的结合，IgA介导的结合半衰期往往比IgG更长（图3J）。此外，IgA与FcαR/FcRγ链复合物的化学计量更高，FcγRIIa只能通过位于其细胞质尾部的一个ITAM（基于免疫受体酪氨酸的激活基序）发出信号，而2:1化学计量的FcαRI会通过FcαRI相关的FcRγ链部署四个ITAM，从而产生更强的信号传导（图5）。加之结合高表达FcγRIIIb与FcγRIIa的竞争作用，导致IgA介导的中性粒细胞肿瘤杀伤作用比IgG更优越。

虽然IgA癌症治疗尚未进入临床试验，但对于那些对IgG治疗无反应或对IgG治疗产生耐药性的患者，IgA治疗可能是一种有价值的补充或替代方案。中性粒细胞是体内最丰富的白细胞类型，加之IgA根据肿瘤类型和位置对中性粒细胞的严格激活可能让IgA疗法成为非常受欢迎的IgG替代方案。中性粒细胞向IgA调理肿瘤细胞的迁移类似于肿瘤细胞死亡之前的集群表型，它可能会破坏免疫耐受的肿瘤微环境并驱动强大的抗肿瘤反应。未来有望通过IgA调动大量中性粒细胞来根除体内肿瘤细胞，改进抗体疗法。

参考文献

Brandsma AM, Bondza S, Evers M, et al. Potent Fc Receptor Signaling by IgA Leads to Superior Killing of Cancer Cells by Neutrophils Compared to IgG[J]. Front Immunol, 2019,10.