微流体技术分离细胞小囊泡

在过去的十年里，微流体技术越来越多地被用作微小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)处理和分离的基本工具，因为它们能够精确和可控地操纵微米和纳米大小的物体。

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根据分离模式，用于sEVs分离的微流体策略在本质上可以分为被动或主动。被动分离方法不需要施加外力，而是通过使用尺寸相关的流体动力或复杂的通道结构（例如，纳米多孔膜和纳米柱阵）来分离sEVs。相反，主动分离方法需要施加外力场，最显著的是声场、电场和磁场来操纵sEVs。

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主动方法已成功用于分离血液衍生的sEVs，并且具有高分离效率的特点。通过基于芯片的介电泳，多项实验证实其可行性。

实验1：从全血中捕获了sEVs（尺寸＜500 nm），随后进行了芯片上免疫荧光测定以检测捕获的sEVs。虽然该方法在隔离sEVs方面是有效的，但由于电极阵列上捕获的sEVs的数量随着时间的推移而增加，导致分离效率下降，因此该方法不能在较长的时间内隔离sEVs。

实验2：使用抗体功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒从全血中捕获sEVs。虽然该方法能够从全血中分离胰腺癌症来源的外泌体，但基于免疫捕获的分离涉及抗体修饰和结合步骤，需要额外的步骤从功能化表面释放完整的sEVs，因此很难在临床环境中进行。

实验3：使用了一种完全不同的策略。使用驻波根据sEVs的大小和密度在sEVs上施加不同的声学力。具体而言，使用一对叉指换能器电极在样品流中产生驻波，从而无需标记即可从细胞培养基中分离外泌体，并从血液中分离红细胞衍生的囊泡。

实验4：提出了一种优雅的声流设备，能够直接从全血样本中分离细胞外小泡。该装置包括一个细胞去除模块，用于去除大的血液成分，然后是sEVs分离模块，用于获得平均直径低于140nm的sEVs。值得注意的是，流体流速的变化和施加到两对叉指换能器电极的RF信号的功率允许基于尺寸对sEVs进行可调隔离。尽管这种方法提供了出色的sEVs隔离效率，但器件的制造和操作都很复杂，这再次限制了在临床环境中的使用。

结合物理过滤的被动微流体系统也已成功用于从全血中分离sEVs。

实验1：一种集成纳米多孔膜（基于多孔聚合物单体）的微流体设备，用于从全血中过滤sEVs和mEVs（<500nm）。由于这些膜很容易被其他血液成分阻断，因此使用电场以实现横流几何形状的电泳分离。

实验2：一种多层膜集成微流体装置，该装置能够从小体积全血中分离sEVs（<200nm）。这里，聚碳酸酯膜用于通过搅拌增强过滤来分离sEVs分离。尽管它具有明显的实用性，但复杂的多层装置结构和对气动“微型搅拌器”（防止装置堵塞）的需求大大限制了它的广泛应用。

实验3：一种替代过滤平台，包括两个孔径分别为20和600nm的膜过滤器，能够在40分钟内从小体积全血中提取sEV。不幸的是，需要进行外部离心使其在研究和临床环境中的使用变得复杂。

实验4：一种级联微流体系统，包括具有600nm孔径膜过滤器的细胞去除电路和包含20nm孔径膜滤波器的EV分离电路，以在30分钟内从10倍稀释的全血中直接分离sEV和mEV。虽然该平台成功地从血液衍生的EV中检测蛋白质生物标志物，回收率较低（10.5%），尽管采用脉动流，但膜污染将操作寿命限制在几分钟内。

与微滤方法不同，基于被动流体动力学分离的技术也可用于血液衍生的sEV分离。

实验1：一种惯性微流体系统，由四个多路通道组成，可以以被动和无标签的方式从全血中分离sEV。尽管报告的装置以高通量（每通道1.2毫升/小时全血）运行，但发现回收率低得令人无法接受（低于20%）。

最近，利用非牛顿流体的粘弹性微流体系统已被证明是用于生物颗粒操作和sEV分离的简单而有效的工具。

实验1：通过在样品流和引导流中加入少量生物相容性聚合物，如聚环氧乙烷（PEO），成功地从胎牛血清（FBS）中分离出sEV和mEV（截止尺寸为200nm）。随后，同一组使用类似的设备将II期癌症样本中的EV分为三个EVs亚组，即sEVs、mEVs和lEVs。

然而，尽管外泌体可以以连续、大小依赖和无标签的方式分离，但该系统尚未用于处理复杂的生物流体，如血液。

实验1：一种振荡微流体装置，该装置能够在相对较短的通道长度上差异聚焦sEVs和lEVs。尽管有效，但由于流动的振荡性质，系统的吞吐量相对较低，因此不适合处理血液.

实验2：一种能够从全血中分离sEVs（平均直径为350nm）的无鞘粘弹性微流体装置。尽管包括红细胞（RBCs）、白细胞（WBCs）和血小板（PLT）在内的大微米级血液成分可以有效去除，但较小的生物物种（平均直径小于1μm）分布在所有出口中，分离效率和回收率较低。

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在临床环境中，迫切需要制造成本低廉、操作简单、不需要专业知识、只需最少的样品制备、产生一致且可重复的结果的EVs分离系统，同时提供高分离纯度和回收率。