CRISPR检测新动向---猴痘病毒检测新策略

上期带大家认识了CRISPR检测在动物、植物、人体不同领域的应用，这期和大家一起分享不同的Cas酶的最新CRISPR检测研究动态有哪些?

CRISPR检测用酶怎么挑选？本文教你轻松区分Cas13a、Cas12a/Cas12b、Cas14

一、CRISPR双重检测技术检测猴痘病毒

最近全球爆发的猴痘病毒（MPXV），加剧了对MPXV检测方法的迫切需要。尽管定量PCR（qPCR）技术目前是猴痘病毒MPXV诊断的金标准，但与该技术相关的高成本和对复杂仪器的需求限制了广泛应用。近年来，CRISPR技术发展迅速，为即时检测病原体提供了有效的工具。本文利用Cas12a酶和Cas13a酶的切割特性，分别检测了MPXV特异性基因、F3L基因和B6R基因。开发了两种检测方案：一种是两步法，其中CRISPR双系统反应和多重重组酶聚合酶扩增反应在单独的管中进行，另一种是单管法，其中两个反应在一个管中进行。对两种方法的评估表明，该方案可以检测MPXV 基因组低至10° copies/μL ，具有良好的特异性，并且与其他痘病毒、假病毒和细菌没有交叉反应。模拟阳性样本用于评估临床适用性，结果显示与qPCR方法的平行检测结果一致。综上所述，本研究为MPXV的检测提供了一种可靠的分子诊断策略。

图1：双重CRISPR检测系统的建立

参考文献

Creating an ultra-sensitive detection platform for monkeypox virus DNA based on CRISPR technology

二、基于CRISPR Cas12b检测技术检测(ALDH)

人醛脱氢酶(ALDH)的SNP rs671在1510个核苷酸处发生G-A的变化；是判断酒精性肝病、消化道肿瘤及某些药物疗效的重要临床指标。常用的多态性基因分型分析相对耗时和昂贵。

本研究建立了一种快速准确的一步CRISPR/Cas12b检测方法，用于区分人ALDH2基因G1510A多态性。所建立的方法只需在预混液加入1 μL基因组DNA样品，等待荧光信号采集，大约30 min。在本研究中使用CRISPR/Cas12b辅助方法来区分ALDH2 rs671 SNP的三种基因型。而且在Cas12b介导的基因分型之前，我们没有结合任何扩增步骤，因为临床DNA样本的拷贝数远远高于该方法的最低敏感度。Cas12b很难接受sgRNA与靶DNA序列之间的任何不匹配，在用于DNA多态性检测时具有更高的特异性和准确性。与传统方法相比，该方法不需要复杂的实验操作、复杂的仪器和长时间的实验过程。我们认为，CRISPR/ Cas12b基因分型检测将在临床疾病的基因诊断和准确治疗中发挥不可替代的作用。 

图2. ADLH2 rs671 SNP基因分型的CRISPR/Cas12b检测方法的建立

参考文献：

Rapid and accurate genotyping of human SNP rs671 in aldehyde dehydrogenase 2 gene using one-step CRISPR/Cas12b assay without DNA amplification

三、基于CRISPR Cas13a检测技术检测(HDV)

丁型肝炎病毒(HDV)感染加速了慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的进展，给患者带来了巨大的经济和健康负担。目前，还缺乏准确、便携的HDV RNA检测方法。www.edgene.cn

在本研究中结合RT-PCR或RT-RAA扩增开发了一种基于CRISPR - Cas13的HDV RNA检测方法，。采用自动核酸提取系统提取血浆样品中的总RNA，并进行热击25 min；然后进行RT-PCR或RT-RAA扩增HDV RNA靶标片段，扩增时间为30 min；利用CRISPR-Cas13a系统检测靶RNA，采用荧光仪器或侧流条检测，耗时30 min。此方法具有较高的灵敏度和特异性，而RT-RAA-CRISPR侧流条法可在85 min内提供准确、便携的检测结果。RT-PCR- crispr与RT-RAA- crispr的区别在于扩增方法，相似之处在于两种方法都使用CRISPR技术进行检测。但RT-RAA-CRISPR技术更容易操作，节省时间。因此RT-RAA-CRISPR技术更适合于现场检测和筛选，具有广泛的应用空间。

图3：检测HDV RNA的crRNA及引物筛选示意图

参考文献：

CRISPR/Cas13a-Assisted Accurate and Portable Hepatitis D Virus RNA Detection