TCR-T细胞疗法的优化，以表现出优越的抗肿瘤疗效

TCR工程T细胞在实体瘤治疗中取得了很大进展，深入了解TCR-T在肿瘤治疗中的最新进展，将有助于理解其发展方向。这里，列出了一些TCR-T临床试验成为实体瘤治疗的一种方法，还总结了TCR-T治疗的优化策略，如肿瘤微环境、TCR配对和亲和力，以提高TCR-T的治疗效果。

TCR工程T细胞疗法(TCR-T)，在体外通过基因工程修饰患者的T淋巴细胞，以提高细胞受体对特定肿瘤细胞抗原的识别和攻击能力。然后，修改后的T淋巴细胞被重新注入患者体内，这样它们就可以有效和特异地识别和杀死肿瘤。因此，它也被称为“T细胞重定向“技术(图1)。

图1 (a) 最理想的抗原靶点应该在正常组织中有最低限度的表达或没有表达，而在肿瘤细胞表面过表达。(b) T细胞一般来自肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或外周血单核细胞(PBMC)。(c) 通过单细胞RNA测序获得TCR序列，以及(d)其基因被克隆并通过病毒载体导入PBMC，(e)安全性和有效性评价(如交叉反应和细胞毒性)；(f)静脉注射TCR-T细胞。

一些肿瘤抗原通过HLA呈递在细胞表面，它们可以被TCR-T细胞识别。为了触发有效的抗肿瘤反应，TCR-T细胞治疗识别和杀伤肿瘤的关键步骤是靶向抗原的选择。合适的靶向抗原有助于提高TCR-T细胞识别肿瘤细胞的效率，增强TCR与肿瘤抗原的亲和力，从而提高杀伤肿瘤的准确性。TCR-T细胞可以识别大多数细胞内和细胞外抗原(下表)。目前研究的肿瘤抗原主要有肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)、致癌病毒表达的肿瘤抗原、蛋白质异常修饰引起的肿瘤抗原。

TCR-T治疗的优化策略

确保TCRα/β链正确配对

众所周知，TCR的功能是由结构决定的，只有当TCR的α/β链正确配对时，TCR-T细胞才能准确识别相关抗原。位于TCR恒定域的“旋钮孔”氨基酸的变化是非常重要的。已经发现，在恒定结构域的界面上增加链间二硫键可以增强TCR链的配对，这将降低错配率。

除了改变α/β的基本结构外，敲除内源性TCRs是防止TCR链错配的最直接方法。内源性TCRs可以通过CRISPR/Cas9技术、siRNA、TAL-ENs和ZFN来敲除。在【CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer】的临床研究中，3名癌症患者参加在由多重CRISPR-Cas9编辑评估T细胞工程的安全性和生存能力。为了加强针对肿瘤特异性NY-ESO-1表位的TCR-T治疗的抗肿瘤免疫，研究人员通过CRISPR-Cas9技术在T细胞中剔除了编码PD-1基因的TRAC和TRBC的天然基因。结果显示，NY-ESO-1特异性TCR-T细胞的扩增增加，T细胞持续9个月，免疫原性最低。类似的研究【CRISPR-based gene disruption and integration of high-avidity, WT1-specific T cell receptors improve antitumor T cell function】也是通过CRISPR-Cas9技术敲除TCR的内源性TRAC和TRBC，避免WT1特异性TCRα/β的错配，并最大化TCR的表达和功能。

尽管与之前的基因组编辑技术相比，CRISPR-Cas9系统具有精确度和有效性，但由于Cas9的高活性和持续活性，基于病毒载体的系统仍可能导致off-target效应。使用非病毒解决方案可能会更有效地解决这一问题。Cas9 mRNA的方法被认为更安全，因为它通过通常消耗较少能量的质粒载体在内部产生Cas9 mRNA。因此，mRNA电穿孔技术是一种无需借助病毒就能产生T细胞的最佳技术。一项关于CRISPR-Cas9通过RNA电穿孔在人T细胞中一步敲除天然TCRα/β基因的研究，作者设计了一种利用RNA进行单次电穿孔的优化CRISPR-Cas9策略。eSpCas9(1.1)-P2A-EGFP在体外与针对人TRAC和TRBC的单链RNA(sgRNA)在激活的T细胞中共转录，导致天然TCR基因的双链断裂，并有效地删除CD8+T细胞中内源性的TRAC和TRBC基因。

改善肿瘤微环境

肿瘤微环境包括非癌症细胞和成分，包括它们分泌的分子。这种微环境通过分泌细胞因子和上调免疫检查点来促进免疫抑制，从而深刻影响T细胞的功能；另一方面，肿瘤血管系统缺乏正常的内皮细胞单层，导致血流不足和各种细胞代谢，最终导致缺氧环境和酸性物质的积累。靶向和修饰肿瘤微环境中的细胞和元素可以有效地控制恶性肿瘤。T细胞上存在许多关键的共抑制受体，如活化后表达的PD-1。PD-1和PD-L1之间的相互作用经常导致T细胞功能衰竭。因此，减少或消除PD-1/PD-L1之间的相互作用是重新激活TME中“耗尽”的T细胞的关键。通过RNA测序发现，在人类非小细胞肺癌的肿瘤微环境中，CD4+ PD-1+ CXCL13+ T细胞是抗原提呈的主要介质。这些辅助性T细胞(Tht细胞)是由呈递肿瘤抗原的树突状细胞启动的，它们的功能被证明是调节PD-1治疗的抗肿瘤反应的关键。然后，研究人员进一步认为，调节Tht和DC之间的检查点相互作用可能是一种重要的免疫治疗干预策略。除了帮助T和B细胞识别抗原外，趋化因子CXCL12和G蛋白偶联受体CXCR4通过抑制免疫反应在肿瘤微环境的发展中发挥关键作用。一些数据表明，CXCR4与表面蛋白CD47具有免疫原性放弃(IGS)功能，这是关于免疫监视相互作用的新发现。研究CXCR4和CXCL12在肿瘤微环境中的功能，发现TCR免疫突触的启动依赖于CXCL12/CXCR4信号。所有这些涉及CXCL12和CXCR4的特异性抗原提呈活动可能成为TCR-T治疗的有价值的辅助手段，同时也为优化肿瘤微环境和增强TCR-T细胞的细胞毒潜力提供了洞察力。

为了改善肿瘤微环境的缺氧，必须解决肿瘤血管异常的问题。研究者发现，胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)及其受体CD93在肿瘤相关的内皮细胞中上调，它们的相互作用导致异常的肿瘤血管形成。发现，抑制CD93途径显著增加了肿瘤中的效应性T细胞，使癌细胞对免疫检查点治疗更敏感。这项研究揭示了肿瘤血管功能障碍的分子联系，并为改善肿瘤微环境提供了新的见解。

联合用药是改善肿瘤微环境的有效途径，使肿瘤获得更好的免疫治疗效果。一项研究已经确定Trametinib和Nintedanib(T/N)是治疗间充质胰腺导管腺癌(PDAC)的一种新的靶向治疗方案。这种治疗可能会重塑人体内的免疫环境。T/N组合诱导T细胞调节剂的分泌，并导致体内间充质PDAC细胞抗原处理和递呈途径的上调。同时，联合用药通过增加血管密度、诱导内皮细胞激活、血管重塑、促进细胞毒作用和效应性T细胞浸润而对TME有很强的作用。该研究为T/N联合免疫治疗间叶性PDAC奠定了基础，并向临床分子分层联合治疗迈出了第一步。这些数据表明，T/N与其他形式的免疫治疗相结合可能会诱导抗肿瘤免疫并改善实体间预后。类似的联合策略已在抗肿瘤试验中显示出令人振奋的结果，例如通过重塑肿瘤免疫环境来联合mitoxantrone、抗TGFβ试剂和PD-1阻滞剂治疗神经母细胞瘤，将Adagrasib和Cetuximab与突变的KRAS G12C联合治疗结直肠癌，通过抑制GDF15联合BET抑制剂和sunitinib治疗黑色素瘤。因此，联合用药可改善肿瘤微环境，提高免疫治疗效果。

赋予TCR最佳亲和力

多肽-主要组织相容性复合体(pMHC)与TCR之间的亲和力对TCR-T细胞的功能至关重要。由于TCR亲和力相关激活阈值的影响，已观察到具有极高亲和力TCR的T细胞表现出快速而有力的反应，尽管持续时间有限。此外，药物对TCR近端和远端信号节点的抑制，如磷酸酶SHP-1/SH-2，也依赖于TCR的亲和力。TCR亲和力可以通过各种技术来提高。研究表明，人TCR可变区的框架可以加强TCR的互补决定区，通过用折叠优化的人TCR可变序列取代针对MAGE-A3(112-120)的人源化小鼠TCR框架以保持结合亲和力，并发现人源化TCR与未经优化的MAGE-A3 TCR(SRm1)相比显示出更高的亲和力和更好的抗肿瘤活性。

研究人员通过随机突变互补决定区(CDR)确定了几个与KRAS G12D具有高亲和力结合的TCR。与KRAS G12D的TCR亲和力比与普遍表达的KRAS WT的亲和力强约100万倍。然而，过高的TCR-配体亲和力可能会对T细胞产生有害影响。用低亲和力的pMHC配体短期刺激初始CD8+T细胞会导致AKT信号转导延迟和细胞增殖，但不会对T细胞造成任何损害。有趣的是，高亲和力的pMHC配体与低亲和力的配体诱导的PAKT信号转导和T细胞增殖水平相似。

此外，T细胞的反应受到额外成分和信号受体的共同调节，与配体的亲和力无关。细胞因子产生的阈值明显低于细胞增殖所需的阈值。促炎细胞因子IL-15可以诱导未经治疗的HIV-1感染者外周CD8 HIV-1 T细胞的旁观者激活。基于前述研究的整合，假设，环境中促炎症细胞因子的存在可能会弥补由于亲和力弱而导致的T细胞增殖信号的不足。事实上，研究人员发现IL-15增加了低亲和力pMHC引发的T细胞的不良增殖，表明促炎细胞因子可能补偿了亲和力依赖的T细胞的增殖。这为今后优化TCR-T细胞的治疗效果提供了启示。

克服抗原异质性和MHC I分子丢失引起的免疫逃逸

在肿瘤形成的早期阶段，肿瘤细胞相对同质。然而，由于基因的不稳定性，同一肿瘤的不同细胞群体之间的抗原表达存在变化，这就是肿瘤抗原的异质性。大多数肿瘤细胞表面MHC I分子表达的减少或消失也导致肿瘤细胞的免疫原性低下。肿瘤抗原的异质性和MHC I的丢失影响ICB的疗效和T细胞的渗透，最终导致免疫逃逸。最近的研究发现，单个TCR可以通过识别3种受HLA-A*02:01限制的抗原来靶向一些不同的肿瘤类型（更多细节可阅读：《一个T细胞多个肿瘤靶点：单个TCR靶向多种肿瘤相关抗原》），这项研究揭示了共享识别基序的重要性。与以往TCR-T细胞对单一表位的识别相比，多表位靶向T细胞对癌细胞的识别能力更强。一种多管齐下的TCR被装备来克服癌细胞征募的一些抗原丢失免疫逃避策略。免疫细胞在免疫反应中发挥着不同的功能，它们之间存在着互补的作用。以前的研究已经报道了一种利用脐带血来源的NK细胞(CB-NKs)来增强CAR T细胞治疗效果的方法。CAR-T细胞与CB-NK细胞联合应用是提高CAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤(MM)疗效的新途径。CB-NK可以防止疲惫和衰老的T细胞在接触MM细胞后出现，这表明它们可以增强CAR T细胞的持久性。同样，CAR-T细胞没有MHC分子限制。TCR-T和CAR-T联合应用可减少MHC I分子丢失引起的免疫逃逸。为了克服CAR-T的一些实际挑战，最近的研究还开发了几种基于CAR技术的新细胞疗法，包括CAR-NK、CAR-M、CAR-γδT和CAR-NKT。这提供一个提示，这些免疫细胞可以联合使用来解决单一ACT的不足。这也为优化TCR-T细胞的抗肿瘤潜能提供了启示。

寻找合适的肿瘤抗原是实现TCR-T细胞治疗高效的关键。联合治疗、细胞因子干预、基因编辑等可提高TCR-T细胞的疗效。然而，诸如TCR亲和力、肿瘤微环境、自身耐受性和交叉细胞毒性等挑战应该得到解决。为了减少或避免这些问题，靶向肿瘤新抗原是一个理想的选择。新抗原没有经过胸腺的负选择，在正常组织中很少或根本不存在。这使新抗原具有独特的肿瘤特异性和高免疫原性。随着基因测序和生物信息学技术的快速发展，快速准确地预测患者的新抗原成为可能。因此，新抗原特异性TCR-T细胞治疗有望成为实体瘤治疗的一种有前途的方法。

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