高分期刊：慢乙肝患者获得临床治愈后肝脏免疫环境显著改变

编者按：

临床治愈是当前慢乙肝最理想的治疗终点，然而，其免疫病理生物标志物和潜在机制尚不清楚。近期，Journal of Hepatology（IF：25.7）上发表的一项新加坡研究深入探索了慢乙肝患者获得临床治愈后的免疫环境改变。肝霖君精选部分重要数据与大家分享。

研究方法：

将单细胞转录组学与基于多参数流式细胞术的免疫表型和多重免疫荧光相结合，以阐明与慢乙肝和临床治愈相关的免疫病理细胞状态。

患者数据：

在本项横断面研究中，将患者分为慢乙肝（CHB，n = 29）和临床治愈患者（FC，n = 9）。

Ÿ 慢乙肝患者基于2017年EASL指南进行分期，大部分为HBeAg +/-慢乙肝。为了对免疫细胞亚群和HBV特异性T细胞进行表型分析，根据其定量HBsAg（qHBsAg）进行分层，分为高（> 10000 IU/mL）、中（1000 - 10000 IU/mL）和低（0.05 - 1000 IU/mL）水平。

Ÿ 临床治愈患者大部分通过治疗获得HBsAg清除，且均为基于干扰素α（IFNα）的治疗，并在HBsAg清除后7 - 84个月之间进行分析。

患者数据（截取部分数据）

研究结果：

一. 临床治愈患者肝脏中的适应性和先天性免疫细胞组成显著改变

与慢乙肝患者相比，临床治愈患者肝内T细胞显著减少，NK细胞和中性粒细胞增多（图1 D、H）。而在对患者的外周血单核细胞（PBMC）进行分析时，未能观察到相同趋势（图1 G、I）。

图1. 从慢乙肝和临床治愈患者中分离的肝脏和PBMC的单细胞转录组图谱

² 在临床治愈患者的肝脏中，免疫细胞组成可能存在特异性变化，而这些变化可能并不总是在PBMC中体现。

二. 临床治愈患者肝脏中CD8 T细胞的耗竭减少，出现与CD4相关的适应性免疫应答

临床治愈患者肝脏中耗竭的PDCD1+ CD8 T细胞显著减少，FOXP3+ Tregs几乎完全清除（图2 A、B），耗竭标志物（如TIGIT、LAG3和PDCD1）显著降低（图2 D）。PBMC中未观察到相同趋势，可能是由于这些细胞在外周循环中的频率较低。

根据qHBsAg水平对慢乙肝患者进行分层，CD8 T细胞的耗竭减少与qHBsAg的降低相关（图2 E）。

此外，与慢乙肝患者相比，临床治愈患者肝脏中耗竭的CD8、CD8 T和记忆样CD8 T细胞中的BCL11B表达减少，表明CD8 T细胞显示出固有样特征。

图2. 临床治愈患者肝脏中耗竭标志物表达降低，先天免疫应答增加及适应性免疫应答改变

在临床治愈患者中，随着耗竭CD8 T细胞和Treg的减少，表达与效应细胞毒性淋巴细胞相关标志物（PRF1、GZMA、GZMK等）的CD4 T细胞数量明显增加（图2 A、B），因此将其称为CD4-CTL。CD4-CTL也表达NCR3基因，类似于NK样细胞的特征（图3 F），表明其获得了固有样细胞功能。

在低qHBsAg（0.05 - 1000 IU/mL）慢乙肝患者中，CD4+ KLRG1+ T细胞频率高于高qHBsAg（> 10000 IU/mL）组（图3 F’’）。表明qHBsAg的降低可能与CD4-CTL的出现有关。

图3. 临床治愈患者肝脏中CD4+ T细胞的改变

² CD4-CTL的产生及CD4-CTL和CD8 T细胞中类-NK固有特性的获得，可能推动临床治愈患者肝内环境从免疫抑制状态转变为免疫激活状态。

三. 临床治愈患者肝脏内的NK细胞处于免疫激活状态

临床治愈患者也表现出经典先天免疫应答的激活。在临床治愈患者的肝脏中，肝脏驻留NK细胞（LR-NK）显著增多，常规NK细胞（cNK）轻度增加（图5 A’）。GO通路分析表明，两种细胞类型的免疫效应功能均有所增加（图5 B、C）。

Ÿ LR-NK细胞通过分泌细胞因子和参与各种细胞类型的信号相互作用来发挥更多的免疫调节作用，例如将DC细胞招募到炎症部位并促进抗原的交叉呈递以重塑肝脏环境；

Ÿ cNK细胞可直接参与抗体依赖性细胞毒性，促进抗病毒T细胞应答。

图5. 慢乙肝和临床治愈患者肝脏内NK细胞频率及差异表达基因的GO通路富集分析

² 临床治愈患者的LR-NK和cNK细胞表现出低级别的免疫激活状态。表明随着qHBsAg水平的降低，活化NK细胞的功能提升呈平缓升高的趋势，强调了与临床治愈相关的先天免疫功能增强的生物学梯度。

四. 临床治愈患者肝内髓细胞环境重塑为免疫激活状态

与慢乙肝患者相比，临床治愈患者全血中中性粒细胞总体频率较低（图6 A、A’），但其中一个成熟的细胞亚群cluster 4频率增加（图6 A’’）。临床治愈患者中上调的基因通路分析显示干扰素应答等通路上调（图6 B、B’）。

与在全血中观察到的结果相反，临床治愈患者肝内的中性粒细胞比慢乙肝患者更多（图6 C、C’）。意味着在临床治愈的患者中，中性粒细胞运输增加，且在肝室内长期驻留。

图6. 慢乙肝和临床治愈患者全血及肝脏内中性粒细胞频率和差异表达基因分析

此外，临床治愈患者肝内CD14+经典单核细胞增加，而CD16+ MARCO+非经典单核细胞减少，表明临床治愈患者的肝脏环境明显重塑为免疫激活状态。

临床治愈患者肝脏中DC2和FOLR2/VSIG4 Kupffer细胞（KC）群明显富集。CellPhoneDB分析显示，DC2和FOLR2/VSIG4 KC都显示出与CD4-CTL和记忆样CD8细胞的强大相互作用，从而表明它们在激活主动免疫应答方面的功能。

² 骨髓细胞在调节肝脏环境从抗炎到免疫激活状态转变中具有重要功能，可能是通过调控FOLR2/VSIG4 KCs增加的病毒抗原呈递和效应细胞的再调节。

² 中性粒细胞作为临床治愈患者持续病毒清除的重要介质，增强先天免疫应答可能在实现临床治愈中发挥重要作用。

五. 临床治愈患者出现MHC Ⅱ类基因高表达的肝细胞可辅助抗原提呈

本项研究从15例慢乙肝患者和8例临床治愈患者中提取了足够数量的肝细胞。对肝细胞进行聚类分析显示，肝细胞的一个亚群（图7 A、A '和A "中Hep_4）似乎与临床治愈特异性相关。Hep_4的特征谱显示MHC II类基因（HLA-A、HLA-B、HLA-C等）高表达（图7 B）。

与临床治愈（Sloss）患者相比，治疗后HBsAg仍阳性（NSLoss）的患者MHC II基因的表达显著更低（图7 G），同时也表现出CD4-CTL耗竭、功能失调。

图7. 临床治愈患者出现MHC II类基因高表达的肝细胞

² MHC II高表达的肝细胞与LR-NK和活化的CD4-CTL的细胞间相互作用增强，可能引发靶向免疫应答，以维持慢乙肝的长期控制。

六. 临床治愈患者肝脏中cccDNA水平显著降低

与慢乙肝患者相比，临床治愈患者肝脏中的cccDNA水平低50倍（图8 A）。此外，临床治愈患者的cccDNA、HBV DNA（图8 B）和3.5 kb HBV RNA（图8 C）水平较低，但3.5 kb HBV RNA与cccDNA的比例与慢乙肝患者相似（图8 D）。

从临床治愈患者样本分离的肝细胞中表达的病毒转录物水平比慢乙肝患者低100 - 1000倍。

图8. 与慢乙肝患者相比，临床治愈患者肝细胞的cccDNA和病毒转录物水平较低

总结

Ÿ 临床治愈患者出现适应性免疫应答改变，这与CD4细胞毒性T淋巴细胞（CD4-CTL）的出现有关

Ÿ 肝脏中性粒细胞募集和着边的增加，提示持续临床治愈患者处于低级别免疫活性状态

Ÿ 临床治愈患者中MHC II类基因高表达的肝细胞可辅助抗原提呈

Ÿ 在慢乙肝临床治愈的背景下，存在低水平的cccDNA和pgRNA，可能会调节改变的适应性免疫应答的识别和再调控

Ÿ 在肝脏环境中发现的免疫细胞状态的改变并不总是反映在外周循环中

肝霖君有话说：

当前，慢乙肝的完全治愈仍较难实现，因此临床治愈仍是最理想的治疗终点。本研究利用多种技术深入阐述了慢乙肝患者获得临床治愈后的肝脏内免疫环境的改变，结果表明临床治愈后，患者肝脏内无论是适应性免疫还是先天性免疫都发生了显著改变，CD8 T细胞的耗竭减少，先天免疫活性提高，肝内环境从免疫抑制状态转变为免疫激活状态。提示我们应用免疫调节剂等疗法激活先天性免疫和/或改变适应性免疫应答，可能存在治愈的机会。

本研究中通过治疗获得临床治愈的患者均为接受基于干扰素α（IFNα）的治疗，前期已有多项研究表明，（PEG）IFNα作为免疫调节剂可以调控多种免疫细胞，以促进临床治愈的实现。可见，目前基于（PEG）IFNα的免疫治疗策略仍是当前追求临床治愈的最佳选择。

参考文献：

Narmada BC, Khakpoor A, Shirgaonkar N, et al. Single cell landscape of functionally cured chronic hepatitis B patients reveals activation of innate and altered CD4-CTL-driven adaptive immunity[J]. J Hepatol, 2024.