CCAT5介导Wnt与STAT3通路交互揭示胃癌治疗新方法

研究背景

胃癌 (GC) 是全球第三大癌症相关死亡原因，因为其诊断时通常已处于晚期；腹膜播散转移(intraperitoneal dissemination,IPD)是GC转移最常见的类型之一，目前化疗药物的腹膜渗透性较差，限制了转移性GC的治疗，因此探究IPD的分子机制刻不容缓。组成型激活的 Wnt/β-catenin 信号通路在胃癌 (GC) 进展中发挥着至关重要的作用，但被批准用于临床的Wnt抑制剂很少。

文献来源

复旦大学附属肿瘤医院胃外科刘晓文、王亚农共同通讯在《Cancer Communications》发表题为"LncRNA-CCAT5-mediated crosstalk between Wnt/β-Catenin and STAT3 signaling suggests novel therapeutic approaches for metastatic gastric cancer with high Wnt activity"的文章，文中鉴定出一种新的Wnt反式激活lncRNA CCAT5，并揭示了STAT3信号通过典型Wnt信号调控的机制，以及CCAT5作为关键中介的功能意义。这项研究提供了概念上的进展，即lncRNA作为治疗靶点可以逆转胃癌的进展。

项目研究

为了筛选参与Wnt信号诱导的GC腹腔播散的功能性lncrna，从13例胃癌伴腹部转移患者的腹水分离纯化原代细胞并建立稳定低表达β-catenin细胞系。

作者使用Wnt3a和β-catenin（S33Y）处理成功建立了Wnt激活的细胞模型后，经lncRNA测序分析筛选得到差异表达CCAT5分子--是最近发现的位于染色体7q36.3上的长链非编码RNA，主要定位于细胞质中。同时结合临床数据库与RT-qPCR证实了CCAT5表达在GC患者中上调且与不良预后相关。

Fig.1 Wnt/β-catenin信号诱导的lncRNA筛选鉴定以及临床数据

Wnt配体通过β-catenin与TCF/LEF转录因子的结合激活信号。过表达TCF3显著提高了CCAT5表达量，其启动子活性因TCF3缺失而严重减弱，相反TCF3过表达后增强。即表明CCAT5可被TCF3因子反式激活。

Fig.2 β-catenin/TCF3复合物反式激活CCAT5

针对CCAT5在GC进展中的基因功能研究，CCAT5 过表达显着增加了GC细胞的增殖、迁移和侵袭能力；通过构建异种移植肿瘤和肺转移模型，发现与体外结果一致，MKN-28-CCAT5组较对照组，肿瘤体积和重量、肺转移结节明显增加。这些结果表明CCAT5在促进胃癌增殖和转移中的潜在作用。

Fig.3 CCAT5促进GC细胞的生长和转移

CCAT5受到Wnt/β-catenin上游信号的调控在上述得到证实，并针对下游作用机制进一步展开探究。

KEGG和GSEA富集分析表明，Jak-STAT是CCAT5 缺失后排名最高的信号通路，随后通过荧光素酶报告基因实验证明STAT3 转录活性被 CCAT5 过表达显着激活，并被 CCAT5 敲低所抑制。过表达CCAT5导致p-STAT3Y705显著增加，在细胞核中大量积累，促进了STAT3的转录活性，从而激活STAT3信号通路。而后又引入使用STAT3 抑制剂 S3I-201 和激活剂 Colivelin进行研究，发现S3I-201中和了CCAT5过表达导致的STAT3靶基因的激活，而Colivelin则逆转了CCAT5敲低引起的STAT3靶基因的抑制，并且细胞的增殖，迁移和侵袭能力仅有明显变化，总的来说证实了CCAT5 在GC进展中的促进作用是由 STAT3 介导的。

Fig.4 CCAT5以STAT3介导的方式促进GC进展

随后作者通过RNA Pull-down 找到了与CCAT5 相互作用的蛋白，证明了STAT3为CCAT5的结合蛋白，并且两者共定位在GC细胞的细胞质中；为了进一步确定 CCAT5 如何调节 STAT3 活性，作者通过构建截短质粒验证STAT3 的C 端结构域是与CCAT5 相互作用所必需的，并且C端结构域中的Y705 残基磷酸化对STAT3的激活是至关重要的。

Fig.5 CCAT5 通过直接与STAT3相互作用并阻断SHP-1介导的STAT3Y705去磷酸化来增强STAT3信号传导活性

结合先前对STAT3 通路的研究，研究表明Wnt3a 和 Wnt/β-catenin 信号传导通过激活肾细胞中的 STAT3 通路发挥作用，所以作者通过将CCAT5敲除及过表达，来研究与Wnt的关系，结果表明Wnt 诱导的 STAT3 激活确实是由 CCAT5 介导的；接下来作者通过构建异种移植肿瘤模型，结果与体外数据一致，CCAT5 缺失显着抑制 β-cateninS33Y 和/或 CCAT5 建立的表达，表明CCAT5 和 STAT3 之间的相互作用是 Wnt 诱导的 STAT3 信号传导激活和 GC 发育所必需的。

Fig.6 CCAT5 和 STAT3 之间的相互作用是Wnt诱导的 STAT3信号传导激活和GC发育所必需的

最后，使用高表达WNT的细胞及低表达WNT的细胞分别构建小鼠肿瘤模型，si-CCAT5注射进行干预后监测肿瘤大小，结果表明高表达WNT的小鼠模型在经过干扰CCAT5基因后，小鼠肿瘤的大小及重量明显降低，同时也降低了细胞的转移情况；并且通过建立5个具有强 β-catenin 核表达的患者来源的 IPD 异种移植物 (PDX) 模型，通过si-CCAT5及奥沙利铂药物处理，发现si-CCAT5 疗法选择性地降低了 Wnthigh转移性 GC 的进展。

Fig.7 基于 RNAi 的靶向 CCAT5 的疗法选择性降低Wnthigh GC 的生长和转移

研究结论

综上所述，本研究鉴定了一种新型 Wnt 反式激活的 lncRNA-CCAT5 的转录机制，提供了 CCAT5 高表达与侵袭性恶性肿瘤和不良预后的相关性。CCAT5 通过直接与 STAT3 结合并阻断 SHP-1 介导的STAT3Y705去磷酸化来激活 STAT3 信号通路以促进 GC 进展。证明了通过siRNA（单独或与奥沙利铂联合使用）可以对 Wnthigh 转移性 GC 起到治疗作用。

Fig.8 GC转移中Wnt/β-catenin-CCAT5-STAT3信号转导轴的图示