转录因子ETV4通过驱动肝脏TNF-α信号通路促进肝癌发展

研究背景

肝细胞癌（HCC）是全球最常见的肝脏恶性肿瘤之一，其发生发展与多种因素相关，其中慢性肝脏炎症是一个已知的主要风险因素。然而，肝脏炎症如何促进肝细胞癌的具体分子机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨ETV4在肝炎症与HCC之间的联系。

文献来源

中国科学院微生物研究所叶昕教授团队等人在Cancer Communications发表了题为“Transcription factor ETV4 promotes the development of hepatocellular carcinoma by driving hepatic TNF-α signaling”的文章。研究表明转录因子ETV4通过激活TNF-α和MAPK11的转录，促进肝脏炎症和HCC发展。ETV4 / TNF-α与ETV4 / MAPK11轴代表了高度相关的肝炎和肝癌的两个潜在治疗靶点，且ETV4+TNF-α可作为肝癌患者的潜在预后指标。

项目研究

研究人员构建HBV转基因细胞系HepG2- 4d14进行RNA深度测序，与HepG2细胞相比，差异表达基因与TCGA-LIHC队列取交集，经分析筛选到参与HCC发展的HBV相关基因ETV4，其中ETV4的表达水平与HCC患者的OS相关性最为显著。

研究发现，ETV4在HCC肿瘤组织中表达上调，其表达水平与HCC患者的生存率呈负相关。与此一致，在HBV相关的HCC肿瘤组织中，ETV4水平上调。这揭示了ETV4有可能是一个潜在的预测HCC患者生存率的生物标志物。

图1  ETV4在HCC和HBV阳性肝组织中高表达，其表达与HCC患者的生存呈负相关

为了探究ETV4调控的下游靶基因，研究人员通过比较ETV4过表达和敲除细胞系的转录谱(图2A-B)，KEGG通路分析发现ETV4上调的基因主要参与TNF、NF-κB和MAPK信号通路（图2C）。在Huh7细胞中，敲低ETV4导致TNF-α和MAPK11的mRNA和蛋白水平降低（图2E），而过表达ETV4的HepG2细胞则增强了TNF-α和MAPK11的表达（图2F-H）。

使用双荧光素酶报告基因检测与CHIP实验，结果表明ETV4可以直接与TNF-α和MAPK11的启动子结合，并增强它们的转录活性（图2I-K）。综上所述，ETV4可以直接促进TNF-α和MAPK11的转录。

图2  ETV4调控TNF-α和MAPK11的转录

接下来，研究人员通过构建肝细胞特异性ETV4转基因小鼠(ETV4Hep-TG)（图3A-B）模型来研究ETV4在肝脏炎症中的作用。ETV4Hep-TG转基因小鼠肝中TNF-α、MAPK11和CD68蛋白水平高于野生型小鼠（图3E-F），提取分离原代肝细胞后TNF-α和MAPK11的mRNA水平明显高于野生型小鼠（图3G）。通过流式细胞术分析发现，ETV4Hep-TG小鼠肝内CD68+和F4/80+细胞明显富集，中性粒细胞水平较高(图3H-I)。在DEN诱导（急性炎症）以及DEN联合CCL4治疗（慢病肝损伤和炎症）中，ETV4Hep-TG小鼠肝脏TNF-α、MAPK11和CD68的表达高于均WT小鼠(图4A-E)。另一方面，ETV4敲除导致TNF-α、MAPK11和CD68水平显著降低(图3C-D，图4F-G) 。综上所述，ETV4通过调节ETV4-TNF-α和ETV4-MAPK11轴，使巨噬细胞积聚并促进肝脏炎症。

图3  ETV4上调TNF-α/MAPK11的表达和肝脏炎症

图4  ETV4增强损伤下肝脏巨噬细胞的积聚和炎症反应

研究人员通过建立DEN-CCL4处理的HCC模型来确定ETV4是否能够促进肝脏肿瘤的发生(图5A)。在该模型中， ETV4敲除小鼠（ETV4fl/fl, alb-cre）的肝脏表面总肿瘤数量、大于1 mm3的肿瘤数量、肝脏/体重比及显微镜下肿瘤数量均低于对照小鼠(图5B-H)。在DEN-CCL4 -HCC模型中，结果与上述相反。ETV4fl/fl，alb-cre小鼠肝组织中TNF-α、MAPK11和CD68蛋白水平低于对照小鼠(图5Q-R)，而ETV4Hep-TG小鼠肝组织中TNF-α、MAPK11和CD68蛋白水平明显高于WT小鼠(图5S -T)。提示ETV4在DEN - CCL4诱导的肝癌发生发展过程中促进了TNF-α和MAPK11的表达以及肝巨噬细胞的浸润。

图5  ETV4促进DEN-CCL4诱导的HCC形成

在人肝癌样本中，ETV4表达与TNF-α、MAPK11表达及肝脏炎症呈正相关。TNF-α水平较高的患者生存率低于TNF-α水平较低的患者，ETV4+TNF-α可作为HCC患者的预后指标。随后分析了肿瘤中ETV4水平与免疫细胞类型评分的相关性，ETV4高的肿瘤中单核细胞(图6O)和巨噬细胞(图6P)多于ETV4低的肿瘤，说明ETV4高的肿瘤中单核细胞和巨噬细胞浸润较多。

图6  ETV4在HCC患者肝组织中的表达与TNF-α、MAPK11的表达显著相关

图7  ETV4模型促进肝脏炎症和肿瘤发生

研究结论

综上所述，本研究发现ETV4在HCC中呈高表达，且其表达与HCC患者的生存呈负相关。ETV4在体内促进肝脏炎症，增强肝脏致瘤性。ETV4可以直接促进TNF-α和MAPK11的转录，并通过增加巨噬细胞和中性粒细胞增强肝脏炎症反应。此外，ETV4+TNF-α水平与肝癌患者的生存呈负相关，这可能是肝癌患者潜在的预后标志物。

原文链接：https://doi.org/10.1002/cac2.12482