克服因突变KRAS表位的翻译后修饰导致的免疫逃逸

克服因突变KRAS表位的翻译后修饰导致的免疫逃逸，实现TCR-T细胞介导的抗肿瘤活性

TCR-T细胞免疫疗法，即通过基因工程使T细胞表达针对肿瘤表位的TCR，是一种过继性细胞疗法，已显示出对多种肿瘤类型的有效性。致癌蛋白KRAS的突变体，特别是在G12位置的突变，是肿瘤发生的主要驱动因素，同时也是TCR-T细胞治疗的理想靶点。然而，尽管有证据表明包含该突变的表位可以与HLA-A2结合并诱导T细胞反应，但在表达最常见的人类HLA-A2的肿瘤中，特异性针对G12突变KRAS表位的MHC I类限制性TCR仍然难以获得。这里，弗雷德哈钦森癌症研究中心研究发现，这种表位上的蛋白质翻译后修饰（PTMs）可能使肿瘤细胞逃避TCR-T细胞的免疫压力。与未修饰的表位相比，Lys侧链甲基化的KRAS-G12V肽可能由肿瘤细胞在HLA-A2上呈现，并影响TCR的识别。通过一种新的计算机指导方法设计TCR，通过诱变开发了能够识别这种甲基化肽的TCRs，增强了对肿瘤的识别和破坏。此外，通过使用修饰后的肽刺激、克隆扩增和选择，在罕见的原代T细胞的正常库中鉴定出了具有相似功能活性的TCRs。从机制上讲，为了确定肿瘤细胞如何甲基化或去甲基化这一表位的机制，进行了一项基因敲除筛选，揭示了SPT6作为一种去甲基化蛋白，可以通过靶向它来提高这些TCRs的效果。这些发现强调了翻译后修饰在免疫逃逸中的作用，并表明识别和靶向此类修饰应有助于开发更有效的TCR-T细胞疗法。

已报道针对由多个HLA（包括HLA-A3、HLA-A11和HLA-C8）提呈的含有G12突变的KRAS表位的TCR，这些TCR不仅在体外识别肿瘤，而且在体内也表现出治疗效果。然而，由于这些等位基因在美国人群中频率较低（例如，HLA-A3为20-24%，而HLA-A11和HLA-C8更为罕见），这种治疗方法的可及性受到限制。在美国，HLA-A2是最常见的等位基因（47.6%）；因此，靶向A2限制性的KRAS表位将使更大比例的人群受益于治疗。然而，定义一个A2限制性的KRAS表位已被证明存在问题，包括在质谱（MS）灵敏度范围内确认跨越G12位置的A2限制性表位存在于免疫肽组中的困难。然而，KRAS-G12V确实有预测与HLA-A2结合良好的表位，特别是5-14位残基（KLVVVGAVGV）。由于MS已经能够从其他HLA等位基因中分离出含有G12V的表位和其他突变的KRAS表位，因此推测HLA-A2表位可能未被天然加工和/或未被HLA-A2有效提呈。

多种机制可能导致预测表位的处理或呈现缺陷，从而导致免疫逃逸。例如，蛋白酶体亚基的差异表达可以改变蛋白质处理为表位的过程，加工后的表位向内质网运输以结合MHC I的过程中出现缺陷，以及MHC I表达或结构上的缺陷。此外，当表位被呈递时，它可能含有翻译后修饰（PTMs），这会导致与未修饰表位反应的TCR完全或部分丧失结合或识别该表位的能力。这些变化包括氧化、亚硝化、甲基化、磷酸化和糖基化；某些PTMs也可能由于恶性转化和酶失调在肿瘤中更为普遍。在突变的KRAS中确实存在PTMs，并可能因迁移模式的改变而干扰MS检测由HLA-A2呈递的KRAS表位，这可能是关于A2表位缺乏共识的原因之一。

确定KRAS-G12V的一个可靶向表位并带有PTM是具有挑战性的，这主要是由于质谱检测PTM时的实验和分析限制，以及在预测治疗性TCR开发的表位时通常忽略了PTM。对于KRAS蛋白，已知PTM发生在C端区域，这些区域因其信号功能而被充分研究，以及N端区域的Lys-5侧链甲基化，后者包含在预测由HLA-A2呈递的表位中。

在这项研究中，证明了KRAS-G12V表位中Lys-5侧链的甲基化可能干扰针对未修饰表位的TCR对KRAS-G12V肿瘤细胞系的靶向作用。通过结合基于机器学习的计算方法来模拟TCR:pMHC界面与高通量实验筛选，开发了能够靶向甲基化和未修饰表位的TCR，从而提供了更广泛的针对HLA-A2+、KRAS-G12V+肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。最后，揭示了一种通常被认为可以减少组蛋白甲基化的蛋白质SPT6在减少KRAS-G12V表位甲基化中的潜在作用。这可能成为肿瘤细胞的一个靶点，以增强通过甲基化靶向的TCR-T细胞的免疫识别，并展示了抑制肿瘤逃避T细胞免疫的一种潜在协同策略。

HLA-A2呈递的KRAS-G12V表位的PTM改变了其被MHC I类限制性TCR识别的情况，并阻止了肿瘤细胞的杀伤

通过NetMHCPan 4.1进行的计算预测，识别出HLA-A2呈递的KRAS-G12V中包含G12V突变的多个表位（图S1a）。在预测的涵盖完整突变KRAS蛋白的前十位表位中，有3个包含G12V突变，其中由残基5-14组成的表位（KLVVVGAVGV）被预测具有最高的亲和力。

为了初次开发针对该肽段的HLA-A2限制性TCR，从HLA-A2阳性的健康供体的PBMCs中分离了原代CD8+ T细胞，并通过使用自体APCs脉冲合成的KRAS-G12V 5-14肽（无任何PTMs）刺激来扩增表位反应性克隆型。通过与HLA-A2:KRAS-G12V(5-14) Tetramer结合的限制浓度测量，分选对KRAS-G12V肽具有潜在高亲和力的细胞。从分选的细胞中，使用ImmunoSEQ测定法（Adaptive Biotech）定量TCR克隆型，并通过单细胞RNA-seq鉴定配对的TCRα/TCRβ序列。在慢病毒骨架中合成在分选群体中优先富集的TCR克隆型作为密码子优化的P2A连接构建体的TCRα和TCRβ，并用于转导CD8+ T细胞。用梯度浓度的KRAS-G12V(5-14)肽刺激细胞，并测量产生的IFNγ表达以评估对这一肽的功能亲和力（图1a；图S1b）。鉴定了两个特别高亲和力的TCR，即TCR19和TCR2，前者表现出最高的功能亲和力。然而，在与HLA-A2+、KRAS-G12V+的胰腺腺癌细胞系CFPAC1共培养时，转导了TCR19的CD8+ T细胞意外地显示出比转导了TCR2的T细胞更差的肿瘤生长抑制效果（图1b），而TCR19相反地在抑制DAN-G肿瘤细胞生长方面优于TCR2，这些细胞也是HLA-A2+和KRAS-G12V+。

这种TCR功能亲和力与不同肿瘤细胞杀伤之间差异的原因尚不清楚。一种可能的解释是同种异体反应性而非肿瘤抗原特异性。对于CFPAC1细胞的杀伤，TCR2对这一细胞系的同种异体反应性不一定可以通过测量该TCR对由另一抗原呈递细胞呈递的肽段的剂量反应来预测。然而，TCR2并未在不表达突变KRAS的其他靶标上诱导对CFPAC1细胞上的任何I类HLA等位基因（HLA-A2、A3、B35、B73、C4、C15；图S1c）的反应。另一种可能是，TCR19对DAN-G细胞的杀伤反映了同种异体识别，但类似的研究未检测到TCR19对DAN-G细胞上等位基因的识别。因此，同种异体反应性不太可能是解释。假设，尽管这两种HLA-A2+ KRAS-G12V+肿瘤细胞都可能呈递该表位，但其中一种可能以修饰形式呈递，而每种TCR对修饰和未修饰肽段的识别存在差异。

在更详细地研究PTMs的存在之前，希望确认预测的主要序列KRAS-G12V 5-14确实能够通过蛋白酶体切割高效生成，并由HLA-A2呈递。为此，使用了ARTEMIS技术，该技术包括基于质谱鉴定与所选HLA I的分泌单链二聚体（SCD）结合的MHC I表位。这提供了一个丰富的、易于纯化的肽结合I类分子来源，可以检测大多数在内质网中内源性加工并加载到I类分子上的肽，并克服了使用质谱识别特定I类等位基因在细胞表面呈递的有限数量肽的挑战。在293F细胞系中建立ARTEMIS系统，该细胞系相比其他哺乳动物细胞系支持异常丰富的蛋白质表达。293F细胞通过慢病毒转导表达了分泌型HLA-A2 SCD以及KRAS-G12V蛋白的截短版本（aa1-100，使蛋白失去功能但保留包含G12V突变的N端部分），以增加含有G12V突变的KRAS-G12V来源肽的可用性，以便与HLA-A2结合。通过ARTEMIS鉴定出3种由HLA-A2呈递的KRAS肽，其中包括KRAS-G12V 5-14肽，这是唯一一个含有突变G12V残基的HLA-A2呈递肽（图1c）。这些结果证实，5-14表位是与HLA-A2相关的KRAS-G12V抗原处理和呈递的主要产物，也是用TCR靶向的正确肽序列。

鉴于在突变KRAS驱动的癌症中已知的甲基化过程失调，以及先前检测到Ras家族蛋白Lys-5侧链甲基化，考虑肿瘤细胞呈现的KRAS-G12V 5-14表位可能包含一定程度的甲基化或其他PTMs的可能性。在确认了表位的主要序列后，假设DAN-G细胞呈现的KRAS-G12V 5-14表位可能是Lys-5甲基化和未修饰表位的某种组合。因此，弱识别的修饰表位的存在可能限制了这些肿瘤细胞被TCR2和TCR19识别，从而限制了肿瘤杀伤。然而，由于293F细胞可能不具备与DAN-G相同的蛋白质甲基化机制，尝试在DAN-G细胞中设计ARTEMIS。不幸的是，由于培养的DAN-G细胞密度低，且蛋白质表达水平低于基于293的ARTEMIS细胞，未能检测到足够的肽以识别甲基化表位。因此，为了寻找可能导致DAN-G细胞内KRAS甲基化增加的甲基化活性差异，还从DAN-G和CFPAC1细胞中进行了全蛋白KRAS的免疫沉淀，随后进行液相色谱-质谱分析。结果显示，在DAN-G细胞中，但在CFPAC1细胞中没有发现Lys-16侧链三甲基化，代表胺基团中的所有氢原子被甲基完全取代（图S1d）。在这组数据中，未能回收或检测到含有KRAS Lys-5的肽，这可能是由于在样本处理过程中胰蛋白酶在Lys-5后立即切割KRAS蛋白，产生了短的5-mer肽，难以用质谱技术检测。因此，虽然无法直接确认Lys-5甲基化肽的存在，但DAN-G细胞中KRAS Lys甲基化的增加模式是明显的。此外，先前的报道清楚地表明，KRAS在Lys残基上存在甲基化，包括Lys-5的二甲基化。Lys侧链甲基化可以是一甲基化、二甲基化或三甲基化，前两种状态是完全甲基化的中间程度。

为了确定带有Lys-5甲基化的KRAS-G12V(5-14)肽是否与未修饰的肽以相似的亲和力结合HLA-A2，评估了HLA-A2:KRAS-G12V pMHC复合物在有无Lys-5侧链甲基化情况下的稳定性。T2细胞缺乏抗原处理相关转运蛋白（TAP），细胞表面表达的正确折叠的I类分子很少。用外源肽脉冲T2细胞可以稳定细胞表面HLA-A2分子的构象，从而增强表面表达，这与肽对HLA-A2的亲和力相关。用带有或不带甲基化的KRAS-G12V(5-14)肽脉冲T2细胞，并测量了HLA-A2的表面表达（图S1e）。与未处理的对照细胞相比，当T2细胞被KRAS-G12V(5-14)肽脉冲时，HLA-A2的表面表达更高。此外，用含有不同程度Lys-5甲基化的相同肽脉冲进一步增加了A2的表达，表明甲基化可能增强表位的稳定呈现。尽管未修饰的肽被两种TCR都很好地识别，但这些TCR识别甲基化表位的能力存在显著差异（图1d）。因此，Lys5的不同甲基化可能解释了这些TCR在杀伤不同肿瘤细胞时观察到的差异。

除了从ARTEMIS检测到的10-mer KRAS-G12V 5-14序列外，另一个预测的含有G12V突变的表位是9-mer（LVVVGAVGV），该表位能与HLA-A2结合（图S1a），之前的研究也报告了通过肽段剪接产生的含有KRAS-G12V 5-6/8-14残基的HLA-A2呈递表位。为了排除这些替代表位被TCR识别的可能性，并测试甲基化表位的识别情况，合成了这些表位变体以及KRAS-G12V(5-14)，包括在Lys-5处进行PTM的多肽。为了确定这些变异表位对TCR的功能亲和力，用这些由HLA-A2呈递的表位刺激表达TCR2或TCR19的T细胞，并测量了随后的IFNγ表达（图1d）。确实，虽然TCR2和TCR19都以相似的程度识别未甲基化的KRAS-G12V 5-14，但只有TCR19对Lys-5侧链氨基甲基化的多肽产生了反应。其他形式的含有G12V的表位，其预测的结合能力较低（如6-14或5-12残基），以及先前认为可能被处理的另一种剪接肽KRAS-G12V 5-6/8-14，均未能引发TCR的反应。因此，DAN-G细胞系可能对其部分KRAS-G12V蛋白或由此产生的表位进行了Lys-5侧链甲基化修饰，使得这种肿瘤细胞呈递的表位无法被TCR2识别。Lys-5甲基化的存在与先前研究中关于RAS家族蛋白，包括KRAS的甲基化结果一致，并且与已知的在突变KRAS驱动的癌症中蛋白质甲基化的失调相符。

基于支持Lys-5甲基化肽对HLA-A2呈递的KRAS-G12V(5-14)表位TCR识别贡献的证据，试图确定这种甲基化可能导致的结构变化。使用Rosetta蛋白质结构建模工具，在Lys-5侧链上引入了单甲基化、二甲基化和三甲基化，并评估了肽在MHC裂隙中定位的变化。这一计算流程表明，在HLA-A2呈递的KRAS-G12V(5-14)中，Lys-5侧链的甲基化会诱导该侧链氨基位置的变化，这可能影响TCR对该表位的识别（图1e）：在未修饰的肽中，Lys-5侧链的氨基从MHC I裂隙中突出，可能接近TCR链，表明它可能作为TCR与pMHC复合体之间的接触点。单甲基化导致氨基被甲基推入MHC I裂隙更深处，而二甲基化或三甲基化则进一步加剧了这一点，这可能解释了甲基化对TCR2或TCR19识别此pMHC复合体的影响。

为了评估Lys-5残基对每个TCR与HLA-A2呈递的KRAS-G12V表位结合的相对贡献，进行了丙氨酸扫描实验，即依次将HLA-A2呈递的表位中的每个残基替换为小而中性的Ala氨基酸。然后，每种单个Ala取代的表位用于脉冲抗原呈递细胞，以刺激表达TCR2或TCR19的CD8+ T细胞，并测量IFNγ以确定整个表位的识别是否受到Ala取代的影响，这表明被取代的氨基酸是TCR的相关接触点。5-14表位的第11位残基已经是Ala，因此用Thr或Gly替代。在肽浓度为0.1µg/ml时，分析显示Lys-5被替换为Ala后，TCR2对表位的反应从67.9%的反应性细胞减少到2.45%（图1f），表明TCR2对该表位位置的变化敏感。Rosetta建模的pMHC复合物与KRAS-G12V表位也显示Lys-5侧链从HLA-A2的沟槽中伸出，朝向可以与TCR相互作用的方向（图S1f，使用与图1e相同的模型，但旋转显示以更清楚地展示这种伸出）。相比之下，TCR19的丙氨酸扫描实验显示，其对KRAS-G12V表位大多数位置的氨基酸取代具有高耐受性，这可能解释了其对甲基化Lys-5的识别，但也表明它可能是多态的，作为潜在治疗性TCR进行改进时不太合适（图1f）。

图1 HLA-A2呈递的KRAS-G12V表位的翻译后修饰改变了MHC I类限制性TCR对抗原的识别及随后的肿瘤细胞杀伤。

图S1 HLA-A2呈递的 KRAS-G12V表位包含一个Lys残基，该残基可以稳定呈递，并且其侧链可能被甲基化。

采用合理突变方法生成识别甲基化KRAS-G12V表位的TCR，以提高对肿瘤细胞的靶向性

识别能够单独或与未修饰肽一起识别KRAS-G12V 5-14肽Lys-5侧链单、二和/或三甲基化的TCR，可能增加对具有KRAS-G12V突变的HLA-A2+肿瘤进行治疗性靶向的能力。为了生成新的能够针对具有3种不同程度Lys-5甲基化肽的TCR，首先探索了一种策略，即对现有TCR（TCR2）的CDR3α区域进行突变，该TCR以高功能亲和力和特异性识别未修饰的KRAS-G12V表位，以确定是否可以在不获得更广泛的非特异性的情况下扩展肽识别范围，包括甲基化变体。

为了确定这个TCR最可能与甲基化位点相互作用的区域，开发了一个新的计算结构预测工作流程（图S1g）。首先使用了Alphafold，该工具利用基于深度学习的方法来预测TCR:pMHC复合物的结构，而不考虑任何PTMs，因为后者在Alphafold中建模不佳。将输出结果输入到Rosetta中，该工具利用基于物理的能量函数来允许对结构进行额外的分子变化建模，例如向表位引入PTMs，然后重新调整结构预测。工作流程应用于现有的能够识别由HLA-A2呈递的未修饰KRAS-G12V 5-14肽的TCR2，揭示了CDR3α区域内的一段核心序列，这段序列最有可能靠近Lys-5侧链及其任何潜在的甲基化修饰（图2a）。

以结构模型为指导，创建了一个合理化的突变库，针对计算确定的核心CDR3α序列。将该库转导到CD8+ Jurkat细胞中，刺激细胞以检测能够识别不同修饰形式的KRAS-G12V 5-14肽的TCR克隆型。转导了该库的T细胞被分析与未甲基化或Lys-5-甲基化的KRAS-G12V(5-14)肽的结合情况。观察到对这两种肽之一或两者都表现出广泛的反应性，证实了计算确定的CDR3α序列在TCR2识别假设的Lys-5甲基化位点中起关键作用。鉴定了几种不同的克隆型，它们能够仅与未甲基化肽结合，或与未甲基化和单/二/三甲基化表位组合结合，或仅与甲基化肽结合（图2b-c），这些克隆型被测序以鉴定相应的突变变体。然后生成了表达这些突变变体TCR的新构建体。使用未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位分别进行了剂量反应测定，以评估转导了每个突变变体的CD8+ T细胞。与TCR2相比，一些突变化的TCR对甲基化表位的识别有所改善（图2d）。剂量反应测定显示，突变化的TCR与TCR2相比，并没有显著获得对野生型KRAS 5-14或替代的KRAS-G12D 5-14表位的识别能力（图S2a）。因此，仅在计算识别的核心CDR3α序列内发生的氨基酸变化能够改变TCR对带有PTMs的肽段的识别模式（图S3a-b），而不会改变对非G12V KRAS表位的识别。对于TCREDST，标记为突变的"核心"CDR3α序列，与HLA-A2呈递的KRAS-G12V表位上的Lys-5侧链最近的氨基酸是Asn和Ser。这些氨基酸分别带负电荷和极性，可以与KRAS-G12V表位上的Lys-5侧链氨基基团发生静电或氢键相互作用。尽管甲基化引入了疏水的甲基基团，但该TCR上的氨基酸的极性性质仍可能允许其与Lys侧链结合。

随后测试了表达增强结合甲基化肽段的TCR变体的CD8+ T细胞是否能够有效识别并杀伤表达KRAS-G12V的肿瘤细胞。在与表达KRAS-G12V和HLA-A2的肿瘤细胞共培养时，表达TCREDST或TCREDRS的CD8+ T细胞，这些T细胞能够识别未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位，显示出对DAN-G细胞的杀伤能力提高，而DAN-G细胞可能呈现未甲基化和甲基化的KRAS-G12V(5-14)，并且与TCR2相比，对CFPAC-1细胞的杀伤能力相似（图2e）。与肽剂量反应实验中无法识别野生型KRAS 5-14或KRAS-G12D(5-14)的结果一致，这些TCR没有抑制仅表达野生型KRAS 5-14的HeLa细胞或表达KRAS-G12D的Panc1细胞的生长（图S2b）。综上所述，对最初天然分离的TCR2进行突变产生了新的TCR，这些TCR能够识别不同的未修饰和不同程度甲基化的KRAS-G12V表位，而不会增加对G12D或野生型KRAS表位的"off-target"识别。

TCR在ACT中应用的一个关键问题是特异性必须仅限于预期目标，以避免脱靶毒性，这在天然分离的TCR发生突变后尤为令人担忧。为了进一步评估所选TCR的特异性，再次在表达CD8αβ、TCR2或TCR19以及Nur77-GFP报告基因作为TCR信号传导特异性标志的Jurkat报告细胞中，对目标表位进行了丙氨酸扫描，以识别突变TCR的结合情况。在0.1µg/ml肽浓度下，定义耐受性为保留>35%响应细胞的Nur77-GFP报告基因表达，结果显示表位上有特定位置可以耐受氨基酸替换并保持刺激性（图S2c）。总体耐受模式为K-x-x-V-V-x-A-x-x-x，其中x表示该位置可耐受Ala替代。值得注意的是，虽然一些TCR能够识别未甲基化和甲基化的Lys-5侧链，但将Lys-5替换为Ala会导致对呈递肽的识别丧失。识别的减少程度大于在其他肽位点发生替换时观察到的程度，表明这个Lys氨基酸仍然是突变TCR的主要接触点，就像它对TCR2一样。对人类肽组进行扫描，寻找能够容纳这些容许残基任何替换的表位，得到了PLD3 396-405、MIGA1 74-83、NAGPA 276-285、K/N/HRAS 5-14、RSLBB 35-44、CFA61 23-32/607-616/667-676、CUL9 635-644/745-754、CLCN6 80-89和MACOI 33-42作为潜在的off-target命中。合成这些肽，并用于刺激TCR-T细胞。与HLA-A2呈递的KRAS-G12V 5-14相比，所有选定的TCR在0.1µg/ml浓度下对这些肽的反应都减弱了（图S2d），这表明突变的TCR没有获得显著的多态性，与原始的TCR2相比。此外，对于TCR2和TCREDST，在更生理的0.01µg/ml浓度下，这些肽引起的反应率低于6%，而KRAS-G12V表位的反应率为18-19%，通过IFNγ表达细胞的百分比测量（图S2e）。

图2 通过计算指导的、合理化的突变库开发识别HLA-A2呈递的KRAS-G12V甲基化表位的MHC I类限制性TCR，并实现对HLA-A2+ KRAS-G12V+肿瘤细胞系的增强靶向。

图S2 从突变库中开发的TCR能够识别HLA-A2呈递的KRAS-G12V的PTM表位，且具有G12V突变特异性。

图S3 Alphafold-Rosetta构建的TCR-pMHC结构模型显示，CDR3α核心与HLA-A2呈递的 KRAS-G12V表位的N端Lys侧链相互作用。

选定的肽刺激原代T细胞并进行克隆扩增，揭示了来自健康供体库的能识别甲基化KRAS-G12V表位并能靶向肿瘤细胞的TCR

通过诱变方法生成的TCR能够特异性地靶向并有效杀伤表达KRAS-G12V及其PTMs的HLA-A2肿瘤细胞系。然而，这些TCR未经胸腺选择过程的天然筛选，因此尽管基于丙氨酸扫描的安全性测试，仍可能存在与其他人类蛋白质组肽交叉反应的风险。因此，为了从正常外周库中鉴定出可能与甲基化KRAS表位结合的TCR，从健康供者的PBMC中分离的原代人T细胞被用KRAS-G12V肽（包括未甲基化、单甲基化、二甲基化和三甲基化Lys-5）刺激，并根据对含有特定HLA-A2:PTM的KRAS-G12V 5-14 Tetramer在限制性肽浓度下的特异性结合进行分选纯化。对纯化的细胞群进行了定量TCR库分析，并合成了高度富集的TCR克隆型并在原代CD8+ T细胞中表达（图S4a, b）。

通过检测TCR转导的T细胞在暴露于由HLA-A2呈递的未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位后的IFNγ表达，这些TCR表现出对G12V突变具有剂量反应模式，对甲基化和/或未甲基化的肽有反应，并且不识别野生型或G12D突变表位（图3a）。这些TCR，包括TCRA2UoM1-1、TCRA2UoM1-2和TCRA2UoM1-4，对未甲基化和单甲基化肽的功能亲和力与突变衍生的TCR相当，特别是TCREDST，其对DAN-G细胞的杀伤能力更强，并且对未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位有强烈的识别。在对甲基化和未修饰肽表现出最强识别的TCR中，表达TCRA2UoM1-1的CD8+ T细胞与肿瘤细胞共培养时，显示出比表达TCR2的T细胞对HLA-A2+ KRAS-G12V+ DAN-G肿瘤细胞系的杀伤能力更强，推测该细胞系呈现甲基化和未甲基化的KRAS-G12V 5-14（图3b）。TCRA2UoM1-1对CFPAC1的杀伤能力与其他TCR相似，后者可能呈现未甲基化的KRAS-G12V 5-14。TCRA2UoM1-1不识别滴定剂量的HLA-A2呈递的野生型KRAS 5-14或KRAS-G12D 5-14（图S4c），但对表达野生型或G12D KRAS的HLA-A2+肿瘤细胞系显示出一定的抑制作用（图S4d），表明可能存在更广泛的靶向。然而，使用TCRA2UoM1-1进行的丙氨酸扫描显示，对KRAS-G12V 5-14表位内的氨基酸替代非常有限的耐受性（图S4e），以至于在人类肽组中唯一潜在的匹配项是EPIPL 1948-1957。使用该肽进行的剂量反应试验显示，该TCR对其没有识别（图S4f），证实了其高度选择性的特异性。

TCRA2UoM1-1的结构建模揭示了一个CDR3α序列，该序列中Asn和Ser与Lys-5 侧链及其不同甲基化形式最为接近（图3c）。这些TCR氨基酸与在突变体TCREDST中鉴定出的相同，因此可能允许这两个TCR与KRAS-G12V表位的甲基化和非甲基化Lys-5均有紧密相互作用。

图3 用未甲基化和甲基化HLA-A2呈递的KRAS-G12V刺激原代人T细胞，从正常库中生成识别甲基化表位的MHC I类限制性TCR

图S4 从原代人类T细胞中鉴定出的TCR特异性靶向由HLA-A2呈递的KRAS-G12V表位

SPT6参与肿瘤细胞中KRAS-G12V表位Lys-5去甲基化的机制，可能是创建稳定表位并用甲基化特异性TCR进行呈递的靶点

接下来试图确定可能参与KRAS-G12V表位甲基化的基因。为此，进行了一项CRISPR-Cas9文库筛选，针对已知与DNA或蛋白质甲基化相关的基因（图4a）。该文库被转导到DAN-G细胞系中，该细胞系被认为表达甲基化的KRAS-G12V(5-14)表位，并且能够被具有甲基化表位特异性的TCR识别，但不能有效被仅对未修饰表位特异的TCR识别。在与甲基化反应性TCR-T细胞（TCREDST）和优先靶向未修饰KRAS的TCR-T细胞（TCR2）共培养前后收集了肿瘤细胞，并确定了存活肿瘤细胞中每种gRNA的频率。选择TCREDST作为比较中的甲基化敏感TCR，因为它与TCR2唯一的不同在于能够识别甲基化Lys-5。分析显示，在与TCREDST共培养时，某些基因敲除的恢复率降低，而在与TCR2共培养时则没有这种现象，这表明敲除的基因可能赋予了肿瘤细胞生存劣势，这可能是由于甲基化表位的呈现增加所致。相反，在相同共培养比较中，针对某个基因的gRNA频率较高意味着敲除赋予了生存优势，从而通过减少甲基化表位的呈现提供了免疫逃逸的手段。

在基因敲除筛选中，DAN-G细胞中SUPT6H敲除（编码SPT6蛋白）的细胞是与甲基化靶向的TCREDST-T细胞共培养相比，非甲基化靶向的TCR2-T细胞共培养中最显著减少的敲除细胞（图4b）。这表明SPT6表达降低了该表位的甲基化。SPT6 传统上被认为是组蛋白Lys甲基化的负调控因子。从数据来看，SPT6似乎具有非传统的抑制KRAS-G12V表位Lys甲基化的作用。

为了进一步研究针对SPT6缺陷型DAN-G细胞的甲基化靶向TCR-T细胞的增强效果，创建了一个SUPT6H基因敲除的DAN-G细胞系。通过目标基因组区域的长读测序验证了成功的敲除（图S5a）。将SUPT6H敲除的DAN-G细胞与转导了TCREDST（靶向未甲基化和甲基化的KRAS-G12V表位）或TCR2（仅有效靶向未甲基化的KRAS-G12V表位）的CD8+ T细胞共培养，证实了SUPT6H的敲除增加了表达TCREDST或TCRA2UoM1-1（也靶向甲基化表位）的T细胞的杀伤敏感性（图4c）。此外，敲除并未增加表达对甲基化无反应的TCR2的T细胞的杀伤作用。相对于原始的DAN-G细胞，SUPT6H敲除并未增加HLA-A2的表达（图S5b），也未改变KRAS的表达水平（图S5c），表明SUPT6H敲除的效果并非由于总表位呈现水平的变化，而是由于表位的PTM组成的变化。

来自TCGA的数据表明，在携带KRAS-G12V突变的癌症患者群体中，SUPT6H的功能丧失型突变导致生存期增加，与整个SUPT6H突变患者群体相比（图4d）。这种特定突变的行为可能表明，在天然存在的TCR库背景下，甲基化的KRAS-G12V表位具有更强的自发免疫原性，这与之前描述的情况一致，即当表位被甲基化时，HLA-A2:KRAS-G12V pMHC复合物在细胞表面的表达更加稳定，而未甲基化时则不然（图S1e）。

图4 基因敲除筛选甲基化相关基因鉴定出SPT6 (SUPT6H)参与HLA-A2呈递的KRAS-G12V表位的去甲基化。

图S5 进一步表征SUPT6H的CRISPR敲除。

总结

开发有效的采用细胞疗法使用TCR需要准确识别由靶向肿瘤特异性呈现的表位，这在PTM的背景下会变得越来越困难。在这项研究中，通过两种方法证明了分离/生成能够识别和靶向可改变肿瘤表位免疫原性的PTM的TCR的能力。深度学习指导的突变使优化一种潜在有前景的针对HLA-A2呈递的KRAS-G12V表位的TCR成为可能，使其能够同时靶向该表位的翻译后修饰和未修饰变体，从而实现对HLA-A2+、KRAS-G12V肿瘤细胞类型的更有效杀伤。还通过选择性扩增来自健康供者原代T细胞群体中对修饰和未修饰KRAS-G12V肽变体反应的罕见克隆型，生成了能够实现类似活性的TCR，从而选择经过胸腺中枢耐受过程的TCR，这意味着它们不太可能对自身抗原产生反应，并可能提供更安全的治疗谱型。对于可能同时呈现未修饰KRAS-G12V表位及其不同程度Lys-5甲基化变体的肿瘤细胞，数据表明，设计或选择能够靶向这些变体广泛范围的治疗性TCR将更有效地杀伤更大比例的KRAS-G12V表达肿瘤细胞，并防止因KRAS Lys甲基化改变或变异导致的免疫逃逸。

计算预测TCR对pMHC复合物的特异性最近取得了显著进展，但纯计算方法仍需实验验证以确定TCR特异性是否足够高，以确保抗肿瘤治疗的安全性和有效性。预测pMHC复合物与TCR之间的三维结构，有可能为基于提议的接触点、肽在pMHC内的取向以及TCR对该复合物的取向，实验性地修改和提高TCR对pMHC的亲和力/特异性提供见解。然而，由于可用于新预测的基础的实验验证的TCR:pMHC相互作用结构数量仍然相对有限，预测模型倾向于根据现有的常见表位过度拟合，以及缺乏阴性对照数据，TCR:pMHC复合物的结构历来难以准确计算确定。最近的计算蛋白质结构预测创新，包括Alphafold，已经提高了准确性。尽管如此，由于缺乏包含PTMs的结构数据用于训练，Alphafold目前还不支持PTMs变化的结构预测。相比之下，Rosetta利用基于物理的能量函数优化蛋白质结构，这更好地适应了将PTMs整合到蛋白质结构预测中。因此，在本研究中，将这两种结合成一种预测，生成了一个更精确的指南，能够准确识别TCR CDR3序列内的pMHC接触位点，这些位点随后可以通过饱和突变进行修饰，以特异性增强TCR与pMHC复合物内翻译后修饰肽的关联。这一策略使我们能够开发出新的TCR，更有效地靶向HLA-A2+ KRAS-G12V+肿瘤，同时保持TCR对突变KRAS的特异性。

MS技术的发展，包括具有更高灵敏度的新技术，使得其可用于鉴定MHC I类限制性T细胞表位。在本研究中，使用了这种MS来表征由HLA-A2呈递的含KRAS-G12V表位的主要序列，类似于先前研究中鉴定由其他MHC I等位基因呈递的突变KRAS表位的研究。这些基于MS的研究对于开发潜在治疗性TCR以针对突变KRAS肿瘤非常重要。然而，MS在检测PTMs方面仍可能不可靠。由于肿瘤表达的多种MHC I和II等位基因所呈现的免疫肽组较大、肿瘤细胞的MHC表达通常减少、蛋白质捕获的低产率以及某些感兴趣蛋白质的低表达，可能导致特定表位及其相关PTMs的检测灵敏度不足。因此，基于MS的工作流程可以从最大化蛋白质表达和MHC捕获中受益，正如本研究中使用ARTEMIS所做的那样。此外，在样品处理过程中引入化学伪影，如氧化，可能会混淆检测到的PTM是否真实存在，而事先未怀疑某肽上存在PTM可能会导致该肽的漏检。为了绕过与表位检测相关的这些困难，并探查呈递表位上的特定PTM，可以使用具有不同PTM-肽识别模式的TCR作为MS的替代方法，因为这些TCR会在靶标呈递具有特定PTM时引发T细胞活化，并且可以作为检测PTM是否存在的一种非常敏感的测定方法。

基于这里为生成针对HLA-A2呈递的KRAS-G12V的TCR所做的努力，TCREDST和TCRA2UoM1-1似乎是进一步开发为治疗性TCR的两个有希望的候选者。前者是通过突变一种天然识别源自突变KRAS的未修饰表位的现有TCR而产生的，而后者则是从健康供体的TCR库中筛选出来的。突变方法可以生成可能不存在于正常库中的TCR，并且对目标的亲和力更高。然而，由于这些TCR序列是从天然存在于库中的TCR突变而来，它们在发育过程中没有经过对自身免疫肽组的自然筛选，因此在治疗环境中存在更高的脱靶活性风险。彻底测试TCR对交叉反应靶点的识别，如通过丙氨酸扫描后鉴定并测试潜在的非KRAS-G12V靶点来进行的，有助于缓解这一问题。此外，此类TCR可用作探针，以识别不同肿瘤呈递的表位上特定的PTM的存在。理论上，从已经中心胸腺耐受的健康供体库中发现的TCR比通过突变生成的TCR更安全，但如果所需的TCR克隆型在库中特别稀少或仅有低亲和力，则可能会受到限制。总体而言，证明了这两种方法都能生成可能有效的、能够针对修饰和/或未修饰肿瘤抗原的治疗性TCR。

研究发现，组蛋白甲基化抑制剂SPT6（SUPT6H）进一步证明了蛋白质PTMs可能通过潜在的非经典过程引入，类似于SMYD3展示出的非经典甲基化活性，这种活性影响KRAS信号通路的其他成分。从研究结果来看，在肿瘤细胞中敲除SUPT6H可以增强针对KRAS、对PTM有反应的TCR-T细胞的疗效。减少SPT6的活性可能为提高肿瘤免疫原性提供另一种机会，例如将这些TCR-T细胞与SPT6的小分子抑制剂联合使用。

对KRAS-G12V抗原Lys甲基化的研究揭示了蛋白质PTMs在改变细胞毒性T细胞识别肿瘤细胞中所起的有趣作用，并提供了一种策略来减轻PTMs的影响，以生产性能更加一致的治疗性TCR。此前已有研究表明，肿瘤相关抗原的PTMs可改变多种肿瘤类型的肿瘤细胞的免疫原性，研究在此基础上描述了一种开发特异性靶向这些修饰的TCR的策略。这一策略为开发特异性靶向PTMs的TCR开辟了新途径，为个性化免疫疗法提供了新的方向。此外，已经鉴定出能够靶向并杀伤携带KRAS-G12V突变的肿瘤细胞的TCR，并且这些TCR受最常见的HLA等位基因限制，因此具有显著的临床开发潜力。鉴于KRAS-G12V突变在多种不同肿瘤类型中的广泛表达，包括许多实体瘤，这些TCR可能使ACT得以发展，以对抗这些通常难以治疗的肿瘤。

肿瘤抗原上发现的PTMs在改变肿瘤细胞免疫原性之外的作用可能非常广泛。以HLA-A2呈递的KRAS-G12V为例，有人推测KRAS中Lys-5的甲基化可能会影响Ras家族信号通路中相关信号蛋白的相互作用。阐明肿瘤抗原上PTMs的机制原因及其后果，可能会为可能的分子途径提供额外的见解，这些途径可以与针对这些抗原的免疫疗法协同或独立地进行靶向治疗。

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