TCR mRNA的瞬时T细胞疗法治疗晚期难治性MSI高直肠癌

之前Else Marit Inderberg的研究已经证明了瞬时转染TCR的T细胞对转化生长因子β受体2（TGFβRII）中的移码突变具有抗肿瘤效果，该TCR靶向HLA-A2限制性的TGFβRII mut抗原，称为Radium-1 TCR。在这里，描述了一项使用mRNA TCR修饰的T细胞治疗进展性、耐药性微卫星不稳定性高（MSI-H）结直肠癌患者的临床方案。在接受12次剂量递增的自体T细胞（电穿孔转染体外转录的Radium-1 TCR mRNA）后，评估了T细胞的细胞毒性、表型和细胞因子产生。通过CT扫描评估了肿瘤标志物和肿瘤生长，并在诊断时评估了免疫细胞的肿瘤浸润情况。在诊断时，肿瘤浸润的CD8+ T细胞除了PD-1外，几乎没有表达耗竭标记。注射的Radium-1 T细胞主要为初始T细胞和效应记忆T细胞，除了TIGIT外，耗竭标记的表达较低。证实了转染的Radium-1 T细胞对靶细胞的细胞毒性，并发现参与肿瘤转移、生长和血管生成的关键细胞因子在治疗过程中波动。该治疗耐受良好，尽管患者患有晚期癌症，但在治疗后仍获得了6个月的生存期并维持了疾病稳定。得出结论，使用Radium-1 TCR mRNA电穿孔转染的自体T细胞治疗转移性MSI-H结直肠癌是可行的、安全的且耐受良好，值得在1/2期研究中进一步探索。

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，根据世界卫生组织和全球癌症观察站的数据，2020年它是癌症相关死亡的第二大常见原因。尽管局部CRC的生存率相对较好，但转移性CRC的5年生存率仅为约11%。错配修复基因的突变导致微卫星不稳定性（MSI）和体细胞突变的积累，这可能导致新抗原的形成。新抗原是过继细胞疗法的有趣靶点，因为它们仅在肿瘤细胞上表达，并且不受宿主免疫细胞的中枢耐受性影响。因此，高MSI（MSI-H）的CRC被认为比低MSI（MSI-L）的CRC更具免疫原性。MSI-H是常染色体显性林奇综合征（LS）中CRC的标志，该综合征使一个人患CRC的风险增加40%-80%。在没有LS的患者中，MSI-H最常见的是一种散发事件，在所有CRC病例中占15%。与其它CRC相比，MSI-H肿瘤富含CD8+和CD4+ T细胞以及其他免疫细胞，因此局部MSI-H肿瘤的复发率较低。然而，转移性MSI-H肿瘤预后较差，尽管ICIs的免疫治疗可以提供良好的抗肿瘤效果，且副作用少于化疗，但30%-50%的MSI-H CRC患者对ICIs无反应。在90%的MSI-H和15%的MSI-L CRC病例中，可以看到TGFβRII的一个特定失活移码突变。之前描述了一种针对这种-1A突变（TGFbRII的核苷酸709-718）的CTL克隆。这种T细胞克隆具有HLA-A2限制的TCR，称为Radium-1，从1名在I期临床试验中对肽疫苗有长期临床反应的患者中分离出该TCR。在临床前研究中，证明了Radium-1 TCR可以重定向T细胞对抗表达TGFβRII移码突变的CRC细胞系。此外，转导了Radium-1 TCR的T细胞显著减少了CRC的生长，并在异种移植NOD/SCID小鼠模型中提高了生存率。

这里，报告了Radium-1 TCR在一位患有LS和晚期转移性MSI-H结直肠癌的患者中首次用于人体的情况，采用mRNA电穿孔技术实现TCR的瞬时表达，以降低脱靶毒性风险。治疗耐受性良好，肿瘤大小稳定，患者的生存期超过了预期。据作者所知，这是首例针对实体瘤新抗原的mRNA TCR疗法的临床报告。

总之，该报告支持针对实体瘤患者新抗原的mRNA TCR T细胞疗法的安全性和可行性，并证实了对治疗性癌症疫苗有反应的患者中鉴定出的TCR的适用性。

病例介绍

一位42岁的LS患者被诊断为伴有肝脏转移的结直肠MSI-H腺癌。尽管进行了化疗，但在次全结肠切除术后疾病仍进展，但在接受35个周期的pembrolizumab单抗治疗后，病情稳定并缓慢进展了2年。鉴于其化疗后的历史进展和有限的治疗选择，他继续接受ICIs治疗。然而，随后他的病情迅速恶化，这与数据表明CRC伴肝转移对ICIs反应有限相符。入组时，停用ICIs 2个月后，患者出现了新的肺部病灶、广泛的肝内转移导致肝内胆汁淤积和门静脉受压，引起脾脏肿大和下腔静脉受压。此外，还发现胃肠道内、淋巴结及腹膜/后腹膜有转移。患者在6周内接受了12次Radium-1电穿孔T细胞的全身输注（图1A和S1），事先已确认靶向抗原特异性细胞毒性及TNF-α/IFN-γ细胞因子的产生（图1B、1C和S2）。总体而言，为了确保TCR mRNA电穿孔T细胞的反应强烈且一致，靶细胞被加载了肽，但这些T细胞也能识别未加载肽段的HLA-A2+ HCT 116细胞系，该细胞系内源性表达突变的TGFβRII抗原，无论是否预先接触过IFN-γ（图S2）。治疗耐受良好，仅有轻微的低热副作用出现在输注后立即发生，未遇到显著的毒副反应。

图1 患者的临床过程和T细胞特征

图S1 输注剂量方案。

图S2 输注的T细胞在极低的肽水平下产生细胞因子并杀死靶细胞。

Radium-1 TCR-T细胞的表型描述

根据流式细胞术分析，扩增和电穿孔后的Radium-1 T细胞中CD8 T细胞的数量约为CD4 T细胞的2倍（图1D），并且主要由初始T细胞（TN）和效应记忆T细胞（TEM）组成，而中心记忆T细胞（TCM）较少（图1E）。对照组T细胞用水电穿孔后也得到了类似的结果。所有输注剂量的细胞活力为82%-95%。输注的Radium-1电穿孔T细胞中，表达PD1、TIM3或LAG3的比例不到10%，而较高比例的CD4+ T细胞（28.3%）和CD8+ T细胞（37.1%）表达了TIGIT。此外，高比例的CD8+ T细胞表达了CD39和CD73调节/耗竭标志物，而CD4+ T细胞中只有很小一部分表达这些标志物（图1F）。

治疗前对肿瘤组织进行细胞分析

在诊断时，即TGFβRII过继细胞疗法前3年，对肿瘤活检样本进行T细胞谱型分析，结果显示，在肿瘤组织中发现的T细胞中有1/3到一半是CD8+ T细胞，并且这些细胞在实质中比间质中更为集中。尽管大多数CD8+肿瘤浸润T细胞未表达LAG3或TIM3耗竭标志物，但有少量细胞表达了PD1，这一现象在实质中尤为明显（图S3和S4）。

图S3 诊断时活检中的T细胞浸润。

图S4 原发肿瘤组织的组织学。

Radium-1 T细胞输注耐受性良好，未出现严重副作用，仅在输注后1-2天出现低热和寒战。未观察到严重副作用，也未出现需要暂停、预用药、剂量调整或其他计划输注方案变更的反应。

患者在整个治疗过程中的一般血液状况和代谢指标均保持稳定。由于存在较大的肝转移病灶，导致胆管受压扩张、瘙痒加剧、胆红素升高和胆汁淤积，患者在ACT治疗中期接受了肝内及外置支架植入。随后，患者的胆红素和瘙痒症状迅速缓解。在接受Radium-1输注期间及治疗完成后，胆红素水平逐渐下降。

血浆细胞因子对Radium-1 T细胞输注的反应

在Radium-1 T细胞输注期间，展示了有趣的促肿瘤和抗肿瘤细胞因子的外周血谱型。最值得注意的是，CXCL10，即人IFN诱导蛋白-10，显著上调，但在最后一次输注时降至基线水平（图2A）。此外，两种抗肿瘤细胞因子， IL-2和IL-12，以及多效性细胞因子IL-10，最初略有增加，然后降至先前水平，但在治疗最后一周和治疗完成后再次增加（图2B）。促肿瘤生长因子PDGF-BB、CCL5（RANTES）和VEGF在治疗期间下调，但在治疗完成后显著上调（图2C和2D）。IL-8（CXCL8）水平最初增加，然后降至基线，但在治疗完成前后再次上升（图2D）。

图2 外周血细胞因子水平和肿瘤反应

Radium-1 T细胞治疗的抗肿瘤活性

通过CT监测了4个不同肿瘤病灶的大小。在各个病灶中观察到混合的肿瘤反应，但根据RECIST 1.1标准，当对比治疗前的CT与治疗完成10周后的CT时，患者病情稳定（图2E和表S1）。这一结果得到了稳定的CEA肿瘤标志物的支持（图2F）。治疗完成后5周的CT显示，一个肝脏和一个腹膜转移灶中有气泡。这一数值在10周时增加，但在19周时再次下降。对转移灶的CT值（HUs）评估显示，在所有时间点均存在坏死，并且随着时间的推移，CT值逐渐降低，表明有中度增加（表S2）。治疗完成后10周左右进行的胆汁培养结果显示，在此期间和影像学检查前后均生长出铜绿假单胞菌。

患者在他的广泛、化疗耐药且进展性疾病预计生存期之外存活。他在完成Radium-1 TCR 输注治疗后6个月（190天）因疾病去世。

表S1 RECIST评分目标病灶大小。

表S2 目标病变的CT值测量。

总结

TCR疗法相较于CARs具有优势，包括更广泛的目标范围、更高的抗原敏感性、降低脱靶毒性和与正常细胞交叉反应的风险，以及表位扩散的前景。此前试验中，交叉反应和亲和力增强的受体已被证明是致命的。这里建议使用mRNA电穿孔技术来解决这一风险，通过短暂表达TCR，可以在出现严重副作用时停止T细胞输注，新的数据支持这种首次用于人体的T细胞疗法的可行性和安全性。

在这里，确认了Radium-1 TCR转导T细胞在晚期MSI-H结直肠癌中的体外有效性和安全性，并展示了其出色的治疗安全性。未观察到交叉反应毒性，副作用很小。患者确诊时，肿瘤活检显示除部分PD-1表达外，耗竭标志物的表达较少。转导的T细胞表现出比预期更高的TN和TEM细胞比例，这可能是因为患者的疾病进展和接受的治疗。尽管在过继性细胞治疗中更偏好较高比例的TCM细胞，但这种表型对于基于mRNA的治疗是可接受的。总体而言，扩增的T细胞表达的耗竭标志物水平较低，尽管TIGIT的表达提示存在预耗竭的TEM细胞，这可能是由之前的治疗和疾病引起的。此外，转导的CD8 T细胞上CD39和CD73的表达表明肿瘤免疫反应受到抑制。转导的T细胞对肽负载靶细胞表现出强大的体外细胞毒性。通常，为了确保高效负载肽，会使用饱和量的肽，因为可用的输注产品有限；然而，在肽浓度低50倍的情况下，仍表现出相当的疗效，并且对内源性表达的抗原也有效。将输注的T细胞与诊断活检中的肿瘤浸润T细胞进行比较，发现输注的T细胞受到长期抗PD-1治疗的影响，支持早期启动靶向治疗。不幸的是，未能按计划在T细胞输注治疗后进行随访肿瘤活检。虽然获取了活检样本，但由于活检中肿瘤细胞数量极少，无法进一步分析，患者也不愿进行第二次活检。这里描述了一例被诊断为抗PD-1耐药转移性MSI-H结直肠癌的LS患者的治疗情况。这类患者较为罕见，自欧洲药品管理局建议将pembrolizumab的适应症扩展至成人转移性MSI-H结直肠癌的一线治疗后，招募新患者变得困难，因此临床研究被迫关闭。

尽管肿瘤大小没有明显减少，但影像学检查显示，根据RECIST 1.1标准，疾病负担在治疗完成后至少9周内得到缓解和稳定。患者的生存情况令人印象深刻，尽管并不独特，因为他在接受二线化疗时进展缓慢。Radium-1治疗的细胞毒性抗肿瘤效应可以解释转移灶中的气泡和通过HUs测量到的坏死增加。坏死也可能由肿瘤体积、缺乏营养和/或血液供应，或感染引起。代谢活性的PET扫描可能有助于了解治疗反应。CEA水平在治疗期间保持稳定，但在治疗完成后突然升高。认为，治疗过程中出现的胆红素暂时升高和瘙痒是由于肿瘤对肝内外胆管的压迫所致。这不太可能是Radium-1输注的直接效应。

CXCL10在治疗过程中的波动与先前的数据一致，表明其在抗肿瘤反应和由IFNγ诱导中的重要性。CXCL10已被与CRC的复发、微卫星不稳定性状态和生存率相关联，并且在HBV相关的肝细胞癌中与基于mRNA的TCR治疗的临床获益有关。PDGF-BB和VEGF促进结直肠癌中的血管生成和有丝分裂。尽管在Radium-1输注期间VEGF被抑制，但在治疗完成后立即上调。STAT1-CCL5似乎对结直肠癌中的细胞增殖很重要，PDGF-BB和CCL5在Radium-1输注期间的减少与肿瘤大小和CEA水平的稳定相吻合。IL-8影响迁移、增殖和血管生成；其在结直肠癌中的水平与较差的生存率相关，可能是因为癌细胞对失巢凋亡的抵抗；并且它与VEGF参与了一个复杂的反馈回路。在Radium-1治疗期间IL-2、IL-10和IL-12的减少，然后在最后几剂时增加并在治疗后进一步增加，可能与表位扩散和抗肿瘤反应的扩大有关，这导致了CT扫描中观察到的肿瘤坏死增加。

总之，该报告支持针对实体恶性肿瘤中新抗原的Radium-1 mRNA电穿孔TCR免疫疗法的安全性和可行性。考虑到15%的CRC是MSI-H型，以及不同MSI状态下的TGFβRII突变在CRC中的预期发生率，可以假设约25%的CRC患者可能携带该突变。Radium-1 TCR所限制的HLA在欧洲和美国的白人中约占50%，但在非洲和亚洲血统的人群中比例较低。因此，总计约有10%-13%的CRC患者可能适合接受Radium-1治疗；然而，这一数字可能会因其他患者特定因素而进一步减少。此外，患有其他MSI-H癌症的患者，如子宫内膜癌、卵巢透明细胞癌和胃癌，理论上也可能从这种治疗中受益。

尽管未表现出显著的肿瘤消退，但在疾病晚期且副作用最小的情况下观察到了肿瘤大小的稳定，这证明了该方法在晚期实体瘤中的可行性。由于其出色的安全性，有必要对肿瘤负荷较低的患者进一步研究TCR-T细胞疗法。

S.M. Maggadottir, et al., Transient TCR-based T cell therapy in a patient with advanced treatment-resistant MSI-high colorectal cancer, Molecular Therapy (2024),

E.M. Inderberg, et al., T cell therapy targeting a public neoantigen in microsatellite instable colon cancer reduces in vivo tumor growth, Oncoimmunology, 6 (2017)

N. Mensali, et al., Preclinical assessment of transiently TCR redirected T cells for solid tumour immunotherapy, Cancer Immunol. Immunother., 68 (2019)