甲状腺未分化癌的基因图谱及NGS液体活检的可行性

甲状腺未分化癌（ATC）是一种侵袭性癌症，需要快速诊断和多模式治疗。下一代测序（NGS）有助于实现个性化治疗和提高试验入组率。基于液体的 NGS 在 ATC 中的作用尚不清楚。本研究使用基于组织的 NGS、基于液体的 NGS 或同时使用这两个平台分析了 ATC 样本。基因改变表现出高度异质性，包括 RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、细胞周期调控、其他受体酪氨酸激酶、DNA 损伤反应、错配修复和染色质重塑突变。TP53（65.4%）和 BRAF（30.8%）是组织 NGS 中最常见的突变基因。在配对样本中，TP53 的一致性为 69.2%，BRAF 的一致性为 84.6%。在两例接受达拉非尼和曲美替尼治疗的患者中，一例患者治疗后组织 NGS 显示拷贝数增加，提示潜在的耐药机制。当组织样本不足时，液体活检可提供有价值的补充信息。需要进一步的研究来了解 BRAF 靶向治疗的耐药机制并开发克服耐药的策略。

研究背景

根据全球多项研究，甲状腺未分化癌（ATC）占所有甲状腺癌的 1.3-9.8%。它是最致命的恶性肿瘤之一，中位总生存期（OS）仅为 4-6 个月，疾病特异性死亡率接近 100%。为了提高生存率，既往研究关注了手术技术改进、放疗设计和新型全身治疗的开发，包括靶向和免疫疗法，然而，ATC 的治疗结局仍然不令人满意。已经识别了几个预后因素，包括年龄、白细胞增多、急性症状、疾病分期、肿瘤大小、既往手术史、既往放疗史和化疗史，然而，仍然需要新的治疗方法来克服 ATC 的侵袭性。

BRAF（V600E）突变在甲状腺癌中较常见，据报道，ATC 中 BRAF 突变的发生率为 35-40%。达拉非尼和曲美替尼分别是针对 BRAF V600E 和 MEK1/2 的酪氨酸激酶抑制剂（TKI），在 BRAF 突变的 ATC 中显示出有希望的效果。在我们之前的研究中，我们回顾性分析了真实世界中达拉非尼和曲美替尼对 BRAF 突变 ATC 的治疗效果，发现达拉非尼和曲美替尼是有效的，显著改善了 ATC 患者的 OS。然而，BRAF 突变 ATC 的获益是有限。耐药性不可避免地发生，患者在疾病进展后很快死于疾病。识别其他潜在靶点和确定靶向治疗耐药机制对于提高 ATC 患者的生存率至关重要。

本研究旨在对台湾 ATC 患者进行全面的基因组分析，识别常见的驱动基因突变，评估已确立的致癌基因突变的频率，发现潜在的新驱动基因突变，确定靶向治疗的候选者。此外，本研究旨在探索 NGS 液体活检的作用，并阐明与 BRAF 靶向治疗相关的耐药机制。

研究结果

26例ATC患者的基线特征

整个研究队列包括 26 例组织 NGS 样本和 15 例液体 NGS 样本（图 1a）。在 26 例接受组织 NGS 的患者中，截至 2024 年 1 月，中位随访时间为 5.4 个月（范围 0.3 至 35.7 个月）。患者的中位年龄为 72.7 岁，性别分布相等。体能状态良好或中等（ECOG PS 0-1：61.5%），既往无分化型甲状腺癌病史（新发 ATC：69.2%），初始 ATC 诊断时存在远处转移（IVC 期：57.7%）的患者比例较高。表 1 总结了详细的基线特征。中位 OS 为 6.3 个月（95% CI：1.8-10.8 个月，图 1b）。

图1

表1

组织NGS

ATC 中的 SNV 具有高度异质性，涉及多条通路，包括 RAS/RAF/MEK/ERK（73.1%）、PI3K/AKT/mTOR（57.7%）、细胞周期调控（92.3%）、其他受体酪氨酸激酶（65.4%）、DNA 损伤反应（50.0%）和 DNA 错配修复（MMR，34.6%，包括 MLH1、MSH6、MSH2 和 PMS1）以及染色质重塑（76.9%）（图 2）。我们的队列中没有检测到 PMS2 突变，但 PMS2 是经过仔细评估的。除了更广泛认可的 MMR 基因（MLH1、MSH6、MSH2 和 PMS2）外，根据 OncoKB，PMS1 也被认为是 DNA MMR 基因。34.6% 的 ATC 患者携带 MMR 突变，但所有突变都是意义不明的变异（VUS），导致队列中没有 MSI-H。在 24 例 TMB 可评估的 ATC 中，只有 1 例 ATC（TMB：7.5 mut/Mb）为 TMB-H（≥7.5 mut/Mb）。

图2

TP53 突变在该队列中最常见（65.4%）。BRAF、NF1、NRAS、KRAS 和 HRAS 突变分别占病例的 30.8%、19.2%、19.2%、11.5% 和 3.8%。所有 BRAF 突变均为 V600E 突变。KRAS 突变包括 1 例 G12V、1 例 Q61H 和 1 例 Q61K。NRAS 突变包括 4 例 Q61R 突变和 1 例 G13R 突变。仅发现 1 例 HRAS 突变（Q61R）。其他受体酪氨酸激酶突变，包括 FGFR3（19.2%）和 ALK（15.4%），频率最高。还发现了 HER、FGFR、NTRK、KIT、PDGFR、MET 和 ROS-1 突变。

关于 PI3K/AKT/mTOR 通路，57.5% 的 ATC 患者携带基因改变。PTEN 缺失（19.2%）最常见，其次是 MTOR（11.5%）和 PI3KCA（11.5%）突变。在 DNA 损伤反应方面，BRCA2 和 BRCA1 分别占 15.4% 和 11.5%。由于缺乏用于进一步分析的配对正常组织，部分病例根据变异等位基因频率怀疑存在胚系 BRCA1/2 突变。此外，在每位患者中仅检测到一个 BRCA1/2 突变，这可能排除了二次打击的发生。还发现了其他参与 DNA 损伤反应的基因。

还评估了 CNV。受体酪氨酸激酶（42.3%）、细胞周期（42.3%）和 DNA 损伤反应（38.5%）相关基因在 ATC 中是主要通路。具体基因 CNV 详细信息如图 3 所示。

图3

液体NGS

15 例患者接受了液体 NGS，其中，13 例也进行了配对组织 NGS，2 例 NGS 组织不足。15 例患者中有 4 例（26.7%）检测到 TP53 和 BRAF 突变（图 4），低于组织 NGS 的检出率。在组织可及性有限或组织 NGS 不可行的患者中，液体活检检测到一个 BRAF 突变，作为基因检测的补充方法。然而，15 例患者中有 8 例未检测到基因改变，需要配对样本来评估组织和液体 NGS 之间的一致性。

图4

配对组织和液体NGS

在 13 对配对组织和液体 NGS 样本中，7 例液体 NGS 未检出基因变异，提示液体 NGS 在识别 ATC 基因变异方面存在固有的局限性（图 5）。总体而言，与组织 NGS 相比，液体 NGS 没有发现额外的基因变异，除了两例样本报告了组织 NGS 未检测到的 ATM 和 EGFR 突变（图 5）。

图5

在 13 例 ATC 患者中，5 例组织 NGS 检出 BRAF 突变，其中 3 例（60%）液体 NGS 也检测到，液体 NGS 检测 BRAF 的灵敏度为 60%，特异性为 100%。BRAF 突变的一致性率为 84.6%，TP53 的一致性为 69.2%。

耐药机制

两例 ATC 患者接受了达拉非尼和曲美替尼治疗，靶向治疗进展后（图 6），他们进行了连续 NGS 检测。1 例患者经历了 2 次进展，导致了额外的 2 次组织 NGS 分析。一例患者在 SNV 方面未发现差异，但观察到一些基因（GNAS、AURKA、SRC、TOP1 等）拷贝数增加（拷贝数：4-6）。

图6

讨 论

与 ATC 相关的不良预后主要归因于常规治疗方式的疗效有限以及对驱动 ATC 肿瘤发生的潜在机制的理解不完全。本研究旨在通过对 26 例台湾 ATC 病例进行全面的基因组分析，评估 13 例 ATC 病例中组织和液体 NGS 之间的一致性，来解决这些挑战。ATC 的基因组图谱揭示了复杂的多条通路，包括 RAS/RAF/MEK/ERK（73.1%）、PI3K/AKT/mTOR（57.7%）、细胞周期调控（92.3%）、其他受体酪氨酸激酶（65.4%）、DNA 损伤反应（50.0%）、DNA 错配修复（34.6%）和染色质重塑（76.9%）。在组织样本不可及或不足的情况下，液体NGS能够检测出更多的BRAF突变 。这些发现凸显了ATC高度异质性的分子背景，揭示了既往未被探索的分子事件。值得注意的是，识别了 HER1/2/3、FGFR2/4、NTRK 1/2/3 和 DNA 损伤反应相关基因突变，靶向这些基因的药物目前正在临床或实验中使用。最后，描绘了队列的突变图谱，揭示了在大多数（尽管不是全部）ATC 病例中观察到的甲状腺恶性肿瘤基因的不同频率。

驱动基因突变检测是 ATC 治疗的关键因素，因为大多数患者无法仅通过手术治愈。高频突变基因包括 17/26 例（65.4%）患者存在 TP53 突变和 8/26 例（30.8%）患者存在 BRAF 突变，这与既往研究数据一致。关于 BRAF 和 TP53 突变对生存的影响，突变型和野生型 ATC 之间未观察到显著差异（BRAF 的 p = 0.729，TP53 的 p = 0.426）。基于 ROAR 研究（BRF117019研究，NCT02034110），达拉非尼和曲美替尼联合治疗是自 2018 年以来唯一被批准用于 BRAF V600E 突变 ATC 的靶向疗法。一些回顾性研究也证实了靶向治疗对 BRAF 突变 ATC 的作用。泛癌种疗法在 NTRK 融合、RET 融合和 MSI-H ATC 中得到应用，这些在当前队列中未发现。然而，识别了其他潜在新靶点，为靶向治疗的开发提供了证据。

关于 KRAS 突变，我们识别了 1 例 G12V、1 例 Q61H 和 1 例 Q61K 突变。索托雷塞和阿达格拉西布已被批准用于携带 KRAS G12C 的非小细胞肺癌（NSCLC）患者。在 14 例携带 G12C 以外的 G12X 突变并在数据截止日期前接受至少 8 周 RMC-6236 治疗的 14 例患者（10 例胰腺导管腺癌（PDAC）和 4 例 NSCLC ）中，客观缓解率为 36%。对靶向治疗的持续研究为治疗具有各种 KRAS 突变的癌症带来了希望。

发现了 4 例 NRAS 突变患者，包括 4 例 Q61R 和 1 例 G13R 突变。目前，针对NRAS突变癌症尚无获批的治疗方法。然而，考比替尼、曲美替尼和比美替尼等 MEK 抑制剂可以稳定 NRAS 突变的转移性黑色素瘤，客观缓解率（ORR）为 18.2%，疾病控制率（DCR）为 48.5%。最近，在接受 naporafenib（一种泛 RAF 激酶抑制剂，200 毫克，每日两次）加曲美替尼（1 毫克，每日一次）治疗的 NRAS 突变黑色素瘤患者中，ORR 为 46.7%。SEACRAFT-1 是一项开放标签研究，旨在评估 naporafenib 与曲美替尼联合治疗经治局部晚期不可切除或转移性 RAS Q61X 实体瘤（包括甲状腺癌）患者的安全性和有效性（NCT05907304）。

DNA 损伤反应（DDR）和细胞周期相关基因改变可能对特定的靶向治疗有重要意义。目前，同源重组缺陷（HRD）是唯一可用于识别 PARP 抑制剂潜在获益患者的预测性生物标志物。PARP 抑制剂单药治疗在通常与 HRD 相关的癌症亚型中得到了广泛研究。此外，有临床试验探索了抗血管生成和免疫疗法联合策略，旨在提高 PARP 抑制剂疗效。应对 DDR，靶向细胞周期检查点（如 ATM、ATR 和 Wee1）的研究正在进行中。

在我们的研究中，循环肿瘤 DNA（ctDNA）的 BRAFV600E 检出率为 26.7%。这与使用 Guardant360 血浆 NGS 检测的 92 例 ATC 的结果相似，这些患者的 BRAFV600E 检出率为 27.2%。然而，这低于历史队列和我们的组织 NGS（30.8%）报告的结果。之前的研究没有评估配对组织和液体 NGS 之间的一致性。根据我们的研究结果，液体 NGS 可能是组织不可及或不足或需要紧急治疗的患者的替代选择。然而，需要注意的是，液体 NGS 不能完全取代组织 NGS，在我们的队列中，13 例患者中有 7 例液体 NGS 结果阴性。

在 13 例进行配对组织和液体 NGS 的患者中，BRAF 的一致性为 84.6%，TP53 的一致性为 69.2%。这种检出率的差异可能归因于 ATC 的特定特征，包括肿瘤负荷和脱落。德克萨斯大学MD安德森癌症中心一项涉及23例ATC患者的研究支持这一观点，该研究表明，在开始根治性治疗前接受双平台测序的患者中，基于一致性得出的推断可靠性最高。相比之下，在治疗后进行游离循环DNA（cfDNA）分析的患者中，推断可靠性最低。因此，组织 NGS 应仍然是确定 ATC 治疗选择的标准方法，除非组织无法获得或不足以进行组织 NGS。

需要识别更多新的靶点和耐药机制。然而，本研究未发现新的靶点。我们发现一些基因的拷贝数增加（拷贝数：4-6），提示 BRAF 靶向治疗的可能耐药机制。但是，需要收集并分析更多病例以确认这些数据。与黑色素瘤和 NSCLC 的内在和外在获得性突变不同，目前关于 ATC 的报道不多。最近，在 ATC 中描述了 BRAF 脱靶耐药机制，包括 RAS 突变、RAC1 突变和拷贝数变异。需要进一步的研究来了解 ATC 对 BRAF 靶向治疗耐药的机制。

本研究的主要局限性仍然是病例数量少，反映了这种癌症的罕见性。然而，鉴于该疾病的侵袭性，这项研究是必要的。由于样本量有限，我们列出了所有检测到的突变以提供全面的数据，包括推定的驱动基因突变和 VUS。有关每种突变致癌性的具体细节，我们还提供了详细数据作为补充材料，使用 OncoKB 结果进行注释，将突变分类为推定驱动基因突变或 VUS。关于特定基因的共存或互斥关系，BRAF 和 TP53 突变不互斥。使用 cBioPortal 进行互斥性分析，由于样本量小，未观察到BRAF、TP53和其他基因之间存在显著的共存或互斥关系（p < 0.05，q 值 < 0.05）。

本研究为 ATC 基因组图谱提供了临床见解，识别了值得进一步探索的潜在新靶点。考虑到这些肿瘤中存在多种异常通路，多靶点治疗策略至关重要。虽然仅液体活检可能不足以识别驱动突变，但当组织不足以进行 NGS 时，它可以提供补充信息。需要进一步的研究来了解 BRAF 靶向治疗的耐药机制并找到克服耐药的方法。

参考文献：

Yeh, CN., Lin, SF., Wu, CL. et al. Genomic landscape and comparative analysis of tissue and liquid-based NGS in Taiwanese anaplastic thyroid carcinoma. npj Precis. Onc. 9, 16 (2025). https://doi.org/10.1038/s41698-025-00802-2

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