[文献解读] : CRISPR基因敲除细胞技术助力肾病治疗

急性肾损伤（AKI）是一个全球性的医疗挑战，它与患者死亡率和发病率的显著增加有关。缺血再灌注损伤（IRI），作为AKI的一个主要原因，通常由肾脏血流的暂时性减少所引发。目前，针对AKI的特定治疗方法尚未被开发出来。在肾脏IRI的早期损伤和修复过程中，CD4+ T细胞等免疫细胞发挥着至关重要的作用。核因子红细胞2相关因子2/kelch-like ECH相关蛋白1（Nrf2/Keap1）信号通路在肾脏疾病治疗中显示出巨大的潜力。尽管药理学激活剂Nrf2已经在临床试验中进行了探索，但其可能带来的副作用仍然是一个挑战。先前的研究已经证实了Nrf2激活对肾脏RI的保护作用，但是关于T细胞特异性Keap1缺失的具体影响，我们还需要进一步的研究来阐明。

为了研究Nrf2/Keap1通路是如何在肾脏IRI中起保护作用，来自美国约翰·霍普金斯大学医学院的研究人员做了一系列的实验，证实了CRISPR/Cas9介导的基因编辑在增强CD4+ T细胞中Nrf2活性方面起到了重要作用，让其成为肾脏IRI的新型治疗方法。其研究成果"T Cell Nrf2/Keap1 Gene Editing Using CRISPR/Cas9 and Experimental Kidney Ischemia-Reperfusion Injury"发表在Antioxid Redox Signal (IF:5.9)杂志上。

科学家们采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，这一技术在人类T细胞中成功实现了Keap1基因的敲除，并促进了Nrf2靶基因的表达。研究发现，小鼠T细胞中Keap1基因的特异性缺失（CD4-Keap1基因敲除[KO]）能够为肾脏IRI提供显著的结构和功能保护。此外，将Nrf2活性增强的Keap1基因敲除小鼠的T细胞转移到野生型小鼠体内，也能有效地保护它们免受肾脏IRI的损害。这项研究证实，CRISPR/Cas9技术在体外对小鼠CD4+ T细胞进行Keap1基因敲除，能够激活Nrf2依赖的抗氧化应答基因，为肾脏IRI提供保护。

一、使用CRISPR/Cas9技术敲除Keap1增强Nrf2靶基因表达

在探究Keap1基因敲除对小鼠CD4+ T细胞中Nrf2靶基因表达的影响时，研究人员采用了三种不同的sgRNA，针对Keap1基因的多个位点进行了单独或组合的实验。他们首先培养了小鼠的原代CD4+ T细胞，然后将sgRNA和Cas9组成的核糖核蛋白（RNP）复合物传递给这些细胞。电穿孔处理后，研究人员收集了细胞，并利用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术来量化Nrf2靶基因的表达，以此评估Keap1-KO的效果。实验结果显示，所有测试的sgRNA，无论是单独使用还是组合使用，都能在电穿孔后24小时显著提高Nqo1、Hmox1和Gclc的表达水平。其中，sgRNA3因其在提高Nqo1 mRNA表达以及显著上调Hmox1和Gclc mRNA表达方面的优势而被选为后续实验的主要对象。此外，研究人员还分析了促炎和抗炎细胞因子的mRNA表达，以确定Keap1-KO可能引起的免疫学变化。与对照组细胞相比，Keap1-KO CD4+ T细胞中Tnfa的表达显著增加，而Ifng、Il17和Il10的mRNA表达则没有显著差异。

图1 Keap1敲除CD4+ T细胞及其对小鼠模型中缺血再灌注诱发AKI的影响的图示

二、Keap1敲除导致抗氧化基因的持续表达

为了研究延长培养时间对Keap1-KO CD4+ T细胞中Nrf2靶基因表达的影响，在电穿孔后，研究人员将对照组和Keap1-KO组的CD4+ T细胞培养时间延长至96小时。通过qRT-PCR评估抗氧化基因表达，结果发现，与对照细胞相比Keap1-KO T细胞中Nrf2靶基因Nqo1、Hmox1、Gclc和Gclm的表达显著且持续上调。结果表明，使用CRISPR/Cas9的Keap1-KO可导致持续的Nrf2激活。

三、免疫印迹分析并证实Keap1敲除

通过免疫印迹分析，研究人员对经过RNP电穿孔96小时处理的CD4+ T细胞进行了蛋白表达水平的评估，以探究CRISPR/Cas9介导的Keap1敲除对细胞的影响。结果显示，Keap1敲除的CD4+ T细胞在Keap1蛋白表达上显著低于对照组，而Nqo1蛋白的表达则在Keap1基因编辑的细胞中增加了50%。这些结果表明，CRISPR/Cas9技术在体外有效地抑制了Keap1-KO CD4+ T细胞中的Keap1蛋白表达，并导致了Nrf2靶基因表达的上调。

图2 在电穿孔24小时后，CRISPR/Cas9介导的Keap1基因敲除增加了培养小鼠的CD4+ T细胞中Nrf2调节的抗氧化剂和细胞因子基因表达

四、Nrf2的持续增强不会诱导CD4+ T细胞的活化或衰竭

为了研究Nrf2持续的活性是否会诱导CD4+ T细胞的活化或衰竭，研究人员使用流式细胞技术和qRT-PCR对Keap1-KO CD4+ T细胞进行分析。在 72 小时的时间点，研究人员观察到 FoxP3 的表达与对照细胞之间没有差异，而且，活化标志物CD25和CD69在两组之间的表达水平也相当。此外Keap1-KO与对照细胞之间TNFa、IFNc、IL17和IL10的细胞因子表达也没有显著差异。

此外，为了确定CRISPR/Cas9敲除Keap1是否会导致离体培养的CD4+ T细胞衰竭，研究人员进一步对共抑制分子的表达进行了评估。结果表明，与对照组相比，在Keap1-KO T细胞中，未观察到与T细胞衰竭相关的共抑制分子起到影响作用。

图3 体外常氧和缺氧条件下，对照细胞和Keap1-KO CD4+ T细胞中的细胞因子和趋化因子表达

五、在体外常氧和缺氧条件下，CD4+ T细胞的Keap1敲除改变了其细胞因子和Nrf2靶基因的表达

为了阐明Nrf2抗氧化的活性增强对肾脏缺血损伤期间肾脏中CD4 + T细胞的影响，研究人员将细胞暴露于体外缺氧条件下展开实验。在常氧和缺氧条件下，与对照细胞相比，Keap1-KO CD4 + T细胞中Nrf2的靶基因Nqo1，Hmox1和Gclm的mRNA水平皆显著增加。然而，在常氧和缺氧条件下，各组之间缺氧诱导因子1α（Hif1a）和B细胞淋巴瘤2（Bcl2）的表达并没有显著变化。

此外，研究人员还对Keap1-KO CD4 + T细胞的培养上清液进行了流式微珠阵列（CBA）分析，并发现与未编辑的对照细胞相比，Keap1-KO中的IL2和IL6在常氧和缺氧条件下均显着降低。此外，在缺氧条件下，IFNc水平显著升高，而在常氧条件下，Il6水平降低。

图4 Keap1-KO CD4+ T细胞的过继转移可实现对IRI的功能保护

六、Keap1-KO CD4+ T细胞免疫治疗改善患有IRI的肾功能

在评估Keap1-KO CD4+ T细胞在小鼠肾脏IRI模型中的治疗潜力时，研究人员进行了一项实验，将Keap1-KO或对照CD4+ T细胞过继转移到nu/nu小鼠体内，并进行了IR手术。实验结果表明，与接受了对照CD4+ T细胞的小鼠相比，那些接受了Keap1-KO CD4+ T细胞的小鼠血浆肌酐水平显著降低，尽管在各组间的外髓质坏死小管没有显著差异。此外，对受体小鼠肾脏进行的免疫表型分析证实了过继转移的CD4+ T细胞已经成功到达肾脏，并且相较于对照组，Keap1-KO CD4+ T细胞中CD25的表达显著减少，TNFa的表达也呈现下降趋势。然而，从缺血后的肾脏中分离出的Keap1-KO细胞在CD69表达或细胞内IFNc水平上并没有差异。对受体小鼠肾脏中的CD4+ T细胞进行的分析还发现，FoxP3的信号非常弱，这可能是由于这些细胞的数量较少所致。

图5 确认受体肾脏的过继转移和免疫表型

研究结果表明，CRISPR/Cas9基因编辑技术通过增强CD4+ T细胞中的Nrf2活性，为治疗肾脏IRI提供了新的可能性。研究人员通过敲除负调控Nrf2的Keap1基因，创建了具有提高抗氧化能力的Keap1-KO CD4+ T细胞。这些细胞能够持续激活Nrf2，上调抗氧化基因表达，并在过继转移到nu/nu小鼠肾脏IRI模型中后，显示出改善肾功能的潜力。这项工作强调了CRISPR/Cas9技术在精确基因敲除和开发治疗性基因工程细胞方面的应用前景，为肾脏疾病的治疗提供了新的视角。